Vloga metilacije RNA pri uravnavanju usode matičnih celic

Uvod

Metilacija RNA spada med epigenetske modifikacije, za katere je značilno, da brez spreminjanja nukleotidnega zaporedja vplivajo na izražanje genov. Uravnavajo stabilnost molekule RNA, določajo njeno lokalizacijo in transport ter regulirajo izrezovanje intronov (1). Proces metilacije katalizirajo posebni encimi metiltransferaze ali t. i. “zapisovalci,” ki interagirajo z RNA-vezavnimi proteini in metilno skupino dodajajo na dušikove baze nukleotidov. Ravno obratno encimi demetilaze oz. “odstranjevalci” odstranjujejo metilne skupine in na ta način vplivajo na drugačno gensko ekspresijo. Za prepoznavanje metiliranih regij in vezavo določenih faktorjev pa so odgovorni specifični proteini, imenovani “bralci” (2). Najpogostejše so metilacije N6-metiladenozina (m6A), N7-metilgvanozina (m7G), 5-metilcitozina (m5C) ter N1-metiladenozina (m1A) (1). Tak mehanizem urejanja RNA lahko v specifičnih celicah, kot so npr. matične celice, vodi do sprememb pri samoobnavljanju oz. staranju celic, diferenciaciji, njihovem razvoju v različne celične linije itd.

Odrasle in zarodne matične celice

Matične celice zajemajo vse nespecializirane celice v našem telesu, ki so jim skupne zmožnosti samoobnavljanja, neomejene proliferacije ter diferenciacije v različne celične linije. Glede na razlike v naštetih sposobnostih lahko med sabo ločimo različne vrste matičnih celic, ki jih v grobem lahko delimo na embrionalne oz. zarodne matične celice (ESC – embryonic stem cells) in odrasle matične celice (ASC – adult stem cells) (3). ESC se nahajajo v notranjosti blastociste zarodka, odlikuje pa jih sposobnost diferenciacije v katerokoli vrsto celice odraslega organizma – so pluripotentne. ASC pa so prisotne v specifičnih organih in so se za razliko od ESC zmožne diferenciirati zgolj v sorodne vrste celic tistega tkiva, v katerem se nahajajo – so multipotentne (3).

Metilacije m6A (N6-metiladenozin)

Metilacije m6A so najpogostejše metilacije mRNA pri evakriontih, s povprečno 3 do 5 metilacijami na posamezno molekulo mRNA, v približno tretjini molekul. Najpogosteje so lokalizirane na 3’-neprevajajočih se regijah, na stop kodonih in na dolgih, internih eksonih. Pomembno vlogo imajo v jedru in citosolu, kjer vplivajo na stabilnost mRNA, izrezovanje intronov, translacijo mRNA, njeno razgradnjo in eksport iz jedra. Metilacije posledično vplivajo tudi na druge procese, kot so diferenciacija matičnih celic in formacija tumorjev (4). Z večjo frekvenco se metilacije m6A pojavljajo na mRNA genih za proteine, ki imajo vlogo v razvoju in diferenciaciji (manjšo količino metilacij imajo stabilne mRNA, prevedene iz “hišnih” genov).

Zapisovalci, bralci, odstranjevalci

Za regulacijo metilacij m6A v jedru in citoplazmi so potrebni proteini “zapisovalci”, “bralci” in “odstranjevalci”. “Zapisovalec” metilacij m6A je metiltransferazni kompleks (MTC), ki ga sestavljajo podenote METTL3 (metiltransferazi podoben encim 3), METTL14 (metiltransferazi podoben encim 14) in drugi proteini. METTL3 deluje kot glavna katalitična podenota kompleksa, METTL14 olajša vezavo kompleksa na RNA in prepozna substrat, na katerega se veže (5). Ker je celoten proteinski kompleks lokaliziran v jedru, je tako omogočena kotranslacijska metilacija prekurzorske mRNA. V jedru se prav tako nahajajo “odstranjevalci” oziroma demetilaze, ki količino m6A metilacij regulirajo z odstranjevanjem metilne skupine. Iz prekurzorske mRNA odstranjuje metilne skupine protein ALKBH5 (AlkB homolog 5) in protein FTO (z maščobno maso in debelostjo povezan protein) (6). “Bralci” so RNA-vezavni proteini družine YTH, ki prepoznavajo metilacijo s svojo YTH domeno. Nahajajo se v jedru in v citoplazmi in imajo na RNA različne vplive. V jedru se na prekurzorsko RNA, ki ostane metilirana, vežejo jedrni “bralni” proteini, ki vplivajo na izrezovanje intronov, transport v citoplazmo in druge jedrne procese. V citoplazmi se nato vežejo citoplazemski “bralni” proteini, ki vplivajo na stabilizacijo mRNA, njeno translacijo in lokalizacijo. “Bralci” sami na te procese vplivajo posredno. Vežejo se na metilno skupino, vezano na adenin ter interagirajo z drugimi proteini, ki RNA npr. razgradijo, omogočajo hitrejšo translacijo, pomagajo pri prenosu iz jedra v citoplazmo …(6)

Diferenciacija matičnih celic

V zarodnih matičnih celicah metilacija m6A vpliva na stabilnost mRNA, ki zapisuje za proteine, povezane z diferenciacijo celic. Eden izmed teh proteinov je transkripcijski faktor Nanog. Nanog v zarodnih matičnih celicah pripomore k ohranjanju pluripotentnosti z represijo determinacijskih faktorjev. To so proteini, ki vplivajo na determinacijo in kasnejšo diferenciacijo celic. Če je mRNA, ki zapisuje za protein Nanog, m6A metilirana, je ta v celici manj stabilna in je izražanje proteina manjše. Če se izražanje proteina, ki ohranja pluripotentnost, zmanjša, se zmanjša represija determinacijskih faktorjev in diferenciacija celice lahko poteče. Podobno delovanje ima metilacija m6A tudi na druge proteine, ki ohranjajo pluripotentnost v zarodnih matičnih celicah, kot je protein Sox2. (7)(8)

Metilacije m7G (N7-metilgvanozin)

Poleg metilacije m6A ima veliko vlogo pri določanju usode matičnih celic tudi dodajanje metilne skupine na N7 dušik gvanina –metilacija m7G. Modifikacija je značilna za tRNA, rRNA (1), miRNA in morda kot m7G kapa najbolj znana na 5’-koncu mRNA (2).

Kompleks METTL1/WDR4

Med zapisovalci za metilacijo m7G je najpomembnejši METTL1 (metiltransferazi podoben encim 1), ki skupaj s kofaktorjem WDR4 (WD ponavljajoča se domena) tvori metiltransferazni kompleks (2). Naloga WDR4 je, da olajša vezavo RNA verige v kompleks, nato pa METTL1 doda metilno skupino, pri čemer je mehanizem soroden metilaciji m6A z METTL3 in METTL14. Metiltransferazni kompleks prek metilacije stabilizira tRNA, kar vpliva na aktivnost ribosomov in vodi v pospešeno translacijo. Poleg tega v ESC WDR4 spodbuja vezavo med iniciacijskimi faktorji in mRNA, ki zapisuje za ciklin B. Na ta način je pospešen prehod iz faze G2 v fazo M, kar vodi v povečano proliferacijo celic (9). V ASC pa so povečano prisotnost kompleksa METTL1/WDR4 opazili v živčnih celicah, kjer je utišanje gena za METTL1 privedlo do znižane stopnje nevrogeneze (1).

Metilaciji m5C (5-metilcitozin) in m1A (N1-metiladenozin)

V primerjavi z metilacijama m6A in m7G sta metilaciji m5C in m1A manj pogosti in zaradi pomanjkanja dobrih detekcijskih metod slabše raziskani. Vseeno pa so v zadnjih letih odkrili nove tehnike sekvenciranja (10), s katerimi so uspeli identificirati njune pomembne bralce in zapisovalce. Za obe modifikaciji je značilno, da v ESC stabilizirata mRNA in na ta način povečata njihovo namnoževanje. Z vidika ASC pa je potrebno upoštevati, da so tako kot metilaciji m6A in m7G, tudi metilacije m5C in m1A tkivno-specifični – njihova lokacija, število in vloga se razlikujejo glede na vrsto tkiva. Zapisovalci za metilacije m5C lahko metilno skupino dodajo na male nekodirajoče RNA, s čimer posredno vplivajo na diferenciacijo epidermalnega tkiva. Metilacije m1A pa lahko pospešijo diferenciacijo in proliferacijo živčnih celic ter gliogenezo. Oba tipa metilacije prek stabilizacije tRNA pomembno vplivata na homeostazo in samoobnavljanje krvotvornih matičnih celic (HSC).

Medsebojni vpliv

Modifikacije RNA lahko preko kompleksnih mehanizmov in kofaktorjev vplivajo tudi na epigenetske procese (1). Temu pojavu pravimo medsebojni vpliv med različnimi signalnimi potmi. V grobem lahko medsebojni vpliv razvrstimo v tri kategorije. Modifikacije RNA oz. njihovi bralci lahko usmerjajo vezavo metilaz ali demetilaz DNA na specifična mesta genoma in tako vplivajo na metilacijski vzorec DNA in nadaljnje izražanje genov. Interakcije lahko potekajo tudi med metilacijami RNA in histonskimi modifikacijami. Metiltransferazni kompleksi lahko prepoznajo določene histonske modifikacije in se v njihovi bližini vežejo na RNA polimerazo II. Na ta način se ob transkripciji na RNA ustvarijo podobni metilacijski vzorci kot na matrični DNA. Gre za neke vrste epigenetsko povratno zanko – modifikacije histonov vplivajo na metilacijo RNA, ta pa uravnava izražanje encimov, ki modificirajo histone (1). Kot tretjo kategorijo pa bi lahko obravnavali medsebojni vpliv med metilacijami RNA in regulatornimi nekodirajočimi RNA. Modifikacije ncRNA vplivajo na njihovo stabilnost, kar vodi do sprememb v njihovi sposobnosti utišanja genov – med njimi tudi genov za modifikatorje RNA.

Zaključek

RNA metilacije so torej dinamični procesi, ki preko vpliva na metabolizem RNA posredno vplivajo na diferenciacijo in proliferacijo zarodnih in odraslih matičnih celic. Zaenkrat je na področju metilacij RNA še veliko neodgovorjenih vprašanj, kar pa lahko pripišemo temu, da je področje precej novo. Metilacije je težko opazovati kot dinamične procese skozi različne stopnje diferenciacije in odkrivati, kako točno vplivajo na posamezno stopnjo procesa. Prav tako imajo raziskovalci težave z proučevanjem redkejših metilacij kot so m1A in m5C, saj metode še niso dovolj natančne, da bi določili njihove točne lokacije nahajanja in vplive na proces diferenciacije. Vsekakor pa opažene spremembe v obnašanju matičnih celic ob utišanju specifičnih modifikatorjev RNA ponujajo dobro odskočno desko za nadaljne raziskave na tem področju (npr. v zvezi z rakavimi in nevrodegenerativnimi obolenji, regenerativno medicino ...).

Viri

1. Sun Y, Li J. Mechanistic insights into stem cell fate regulation via RNA methylation. Ageing Research Reviews. 2025 May 1;107:102717.

2. Chen D, Gu X, Nurzat Y, Xu L, Li X, Wu L, et al. Writers, readers, and erasers RNA modifications and drug resistance in cancer. Molecular Cancer. 2024 Aug 30;23(1):178.

4. Zhang M, Zhai Y, Zhang S, Dai X, Li Z. Roles of N6-Methyladenosine (m6A) in Stem Cell Fate Decisions and Early Embryonic Development in Mammals. Front Cell Dev Biol [Internet]. 2020 Aug 11 [cited 2025 Mar 31];8. Available from: https://www.frontiersin.org/journals/cell-and-developmental-biology/articles/10.3389/fcell.2020.00782/full

6. Zaccara S, Ries RJ, Jaffrey SR. Reading, writing and erasing mRNA methylation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019 Oct;20(10):608–24.

9. Liu Y, Zhan Y, Liu J, Shen Z, Hu Y, Zhong L, et al. The 7-Methylguanosine (m7G) methylation METTL1 acts as a potential biomarker of clear cell renal cell carcinoma progression. Translational Oncology. 2025 Jan 1;51:102202.