Podvojevanje DNA

Podvajanje in prenos dedne informacije na potomce je ena temeljnih značilnosti živih organizmov. Ti so tekom evolucije razvili zapleten sistem, ki vključuje delovanje encimov in številnih pomožnih proteinov. Podvajanje DNA je semikonzervativen proces, pri katerem vsaka od obeh starševskih polinukleotidnih verig služi kot osnova (matrica), na podlagi katere se sintetizira komplementarna veriga DNA molekule (nastala DNA vsebuje eno verigo starševske DNA in eno novonastalo verigo). Osnovni encim, ki sodeluje pri tem procesu je DNA polimeraza, ki katalizira povezavo deoksiribonukleozid-5'-trifosfatov (dNTP), ki tvorijo rastočo verigo. Tako prokariontske kot evkariontske celice vsebujejo več vrst DNA polimeraz, ki si delijo vloge pri podvajanju in popravljanju molekule DNA. V prokariontih ima glavno vlogo pri podvajanju DNA encim DNA polimeraza III. V evkariontskih celicah opravljajo vlogo podvojevanja jedrne DNA kar tri polimeraze (α, δ in ε). Podvajanje mitohondrijske DNA pa izvaja DNA polimeraza γ.

Vse znane DNA polimeraze imajo dve pomembni značilnosti, ki vplivata na mehanizem podvajanja DNA:

• Sinteza polinukleotidne verige poteka zmeraj od 5' proti 3' koncu tako, da polimeraza pripaja dNTP na 3'-hidroksi skupino naraščajoče verige.
• Za pripojitev novega dNTP potrebujejo že izoblikovani začetni oligonukleotid (RNA primer), ki je preko vodikovih vezi vezan na matrično DNA. Ne zmorejo namreč katalizirati sinteze de novo, torej prve stopnje sinteze komplementarne verige. V tem pogledu se razlikujejo od RNA polimeraze, ki pa je zmožna začeti sintezo nove verige v odsotnosti začetnega oligonukleotida.

Molekula DNA se pred pričetkom podvajanja razvije, kar ob hidrolizi ATP izvaja encim helikaza. Pri tem pride do tvorbe t. i. podvojevalnih vilic (replication fork). Tako razvito molekulo DNA je potrebno stabilizirati, kar naredijo posebni proteini, ki se vežejo na enoverižno DNA. Polinukleotidna veriga, katere usmeritev v smislu 5' proti 3' koncu je v skladu s smerjo premikanja podvojevalnih vilic oz. razvijanja molekule DNA, se na komplementarni matrični DNA neprekinjeno sintetizira in jo imenujemo vodilna veriga. Veriga, katere usmeritev 5' proti 3' je nasprotna smeri razvijanja molekule DNA, pa se sintetizira po delih v obliki kratkih zaporedij (1.000 - 3.000 baznih parov) v smeri, ki je nasprotna odvijanju molekule DNA in jo imenujemo zastajajoča ali sledilna veriga. Ta kratka zaporedja so t. i. Okazakijevi fragmenti. Poseben encim primaza, ki tvori kompleks s polimerazo α, sintetizira začetne RNA oligonukleotide (dolžine 3 - 10 nukleotidov), ki jih DNA polimeraza α podaljša, da nastanejo kratki RNA-DNA fragmenti, nadaljno sintezo Okazakijevih fragmentov pa izvede polimeraza δ. Vloga DNA polimeraze ε je še nerazjasnjena, domnevajo pa da, podobno kot polimeraza δ, sodeluje pri sintezi vodilne in zastajajoče verige. Da pride do tvorbe enotne verige iz dNTP, je potrebno začetne (RNA) oligonukleotide odstraniti, kar je pri prokariontih vloga DNA polimeraze I, pri evkariontih pa se odstranijo s pomočjo RNaze H in eksonukleaze 5' proti 3' (nukleotide odceplja s 5' konca). Nastale luknje zapolni polimeraza δ, encim DNA ligaza pa katalizira povezavo terminalnih nukleotidov Okazakijevih fragmentov.

Pri procesu podvajanja DNA sodelujejo še številni drugi pomožni proteini. En razred teh proteinov se na primer veže na DNA polimerazo, s čemer poveča njeno aktivnost in jo obdrži vezano na matrični DNA. Tako polimeraza III pri E.coli kot polimerazi δ in ε se povezujejo z dvema tipoma takih proteinov. To so t. i. proteini drseče objemke in pa »clamp-loading« proteini. Ti tvorijo poseben kompleks, ki na DNA specifično prepozna mesto spoja začetnega oligonukleotida in matrične DNA ter se nanj veže. »Clamp-loading« proteini nato sprostijo drsečo objemko, le-ta pa tvori proteinski obroč okrog matrične DNA. Nato veže DNA-polimerazo in ji tako omogoči nemoteno sintezo verige.