Odkritje aktivacije genov z malo RNA (RNAa)

Dlje časa je že znano, da lahko majhne molekule dvovijačne RNA (dsRNA) zavrejo izražanje genov. To se lahko zgodi na različnih ravneh poti izgradnje proteina in z različnimi tipi majhnih RNA molekul, vse pa skupno imenujemo RNA interferenca, oziroma RNAi. Šele leta 2006 pa je bilo odkrito, da imajo lahko dsRNA tudi ravno nasproten efekt in po vstavljanju v celico inducirajo izražanje gena za nek protein, oziroma povečajo morebitno že prisotno izražanje tudi do desetkrat. Pojav povečane ekspresije, kot posledica delovanja majhnih nekodirajočih RNA (ncRNA), skupno imenujemo RNA aktivacija (RNAa). Z odkritjem majhnih aktivirajočih RNA (saRNA) je RNA kot molekula dobila še večji pomen, saj ima očitno zaokrožen nadzor nad ekspresijo in lahko tako z aktivacijo, kot z utišanjem genov odloča o lastnostih celice.

Odkritje RNAa

Odkritje RNAa se je pojavilo precej po naključju, med raziskavo, ciljano na RNAi. Leta 2006 je ekipa raziskovalcev, na čelu z Long Cheng Li-jem, želela bolje preučiti, kako je kontrolirana promotorsko specifična metilacija DNA, še posebno v rakastih celicah. Njihov cilj je bil potrditi domnevno vlogo majhnih RNA pri metilaciji promotorjev določenih genov. Za mnoge tipe rakavih celic je bilo znano značilno utišanje genov za proteine, ki imajo vlogo represije rasti (E-cadherin, p21, VEGF). Zaviranje ekspresije teh proteinov je ključno za neovirano rast raka in zato zanimivo za raziskave. V času te raziskave je bil že 10 let znan mehanizem rastlin, pri katerem ncRNA s specifičnim prepoznavanjem promotorske regije povzroči njeno metilacijo in s tem epigenetsko spremembo, ki prepreči branje gena. Li et al. so se osredotočili na človeški gen za E-cadherin, čigar promotor vsebuje tipično CG bogato regijo (območje DNA, na katerem je veliko gvaninskih in citozinskih baz), ki po metilaciji povzroči utišanje gena. Li-jeva skupina je želela sintetizirati dsRNA, ki bi prepoznala promotor za E-cadherin, vendar so se odločili za drugačen pristop, ki je bil ključen za nepričakovano odkritje RNAa. Kot tarčno regijo si niso izbrali GC bogato območje, temveč so sintetizirali dsRNA, ki bi prepoznala in se vezala na del promotorja, ki ne vsebuje velike koncentracije GC, hkrati pa ustreza vsem ostalim zahtevam za uspešno vezavo siRNA. Rezultat jih je presentil, vendar je bil ponovljiv in nedvoumen: rakaste celice, v katere so vstavili dsRNA, so proizvedle od 2 do 10-krat več E-cadherina, kot kontrolne. Domnevna epigenetska sprememba je povzročila tudi fenotipsko, navzven vidno spremembo. Ker so rakaste celice proizvedle toliko več E-cadherina, se je ustavila tudi rast. Podoben rezultat so dobili tudi pri poskusih, izvedenih na na genih za p21 in VEGF, ni pa dsRNA aktivirala genov za vse raziskovane proteine. Skoraj vzporedno, z manjšim zamikom je raziskovalna skupina Janowski et al. odkrila podoben efekt na genu receptorja za progesteron, kar je kazalo na dejstvo, da je aktivacija transkripcije z malo RNA vsesplošen fenomen. Z odkritjem RNAa se je pojavilo vprašanje o mehanizmu aktivacije prek dsRNA in v kolikšni meri, če sploh, se ta razlikuje od mehanizma RNAi.

Odkrivanje mehanizma

Velik potencial za raziskave in za zdravljenje, ki ga nosi RNAa je nemogoče izkoriščati brez poznavanja točnega mehanizma. Ta do danes v celoti še ni znan, določene ključne značilnosti pa so že raziskane. Glede na okoliščine odkritja RNAa, so vse raziskave o njegovem mehanizmu izhajale iz predpostavke o podobnosti z mehanizmom RNAi na nivoju transkripcije. Znani so mnogi nivoji, na katerih lahko RNA zmanjša izražanje genov, aktivacija pa je zaenkrat znana samo v smislu vezave RNA na promotor in povečane transkripcije. RNA, ki kakor protitelo prepozna določeno zaporedje na promotorju in se veže, imenujemo antigen RNA (agRNA).

Ago proteini

Prve raziskave so ciljale na morebitno asociacijo agRNA in Ago (Argonaut) proteinov, ki so ključni v mehanizmu RNAi. Medtem, ko se Janowski et al. in Li et al. razhajajo glede vlog proteinov Ago 1, 3 in 4, je jasno dokazana ključna vloga Ago2 proteina. Po utišanju gena za Ago2, je bila RNAa popolnoma izničena, prav tako pa je bila dokazana vezava Ago2 in agRNA v kompleks. Domneva, da Ago2 odcepi eno od verig v vezani dsRNA, še ni potrjena.

Vezava agRNA

Logični sklep, da se aktivirajoča agRNA veže direktno na komplementarno sekvenco na kromosomalni DNA, prav tako še ni bil dokazan. Več študij pa je že potrdilo, da se aktivirajoča agRNA, namesto direktno na DNA, veže na nekodirajoč transkript na promotorju. Ko se promotorska regija torej že prepiše, in je nanjo še vedno vezan nekodirajoč transkript, se na slednjega veže aktivirajoča agRNA in tja privlači Ago2 protein. Kompleks agRNA/Ago2, posredno vezan na promotorsko regijo, lahko tako pozitivno vpliva na transkripcijo.

Aktivacija transkripcije

Vprašanje same aktivacije transkripcije s kompleksom agRNA/Ago2 je do danes dobilo več razlag, vsaj ena pa je dokazana. Ker je do odkritja RNAa prišlo prav pri raziskavah metilacije DNA, je dokazana razlaga logično aktivacija transkripcije kot posledica epigenetskih sprememb. Teoretično naj bi torej kompleks agRNA/Ago2, vezan v bližini promotorja, povzročil vezavo ali odcep nekega radikala na ali iz histona in posledično bi se kromatin se razvil. Terijo so podprli tako, da so po vstavljanju znanih aktivacijskih dsRNA z metodo ChIP opazovali spremembe kromatina okrog tarčnih mest agRNA. Po RNAa E-Cadherina v rakastih celicah prostate so naprimer opazili izgubo di- in trimetilacije lizina 9 na histonu 3 (H3K9). Di- in trimetilacija H3K9 je sicer znan vzrok zgostitve kromatina. V drugi raziskavi so ob RNAa gena receptorja za progesteron zaznali znižano acetilacijo na H3K9 in H3K4 ter zvišano metilacijo na H4K4, kar je ravno tako v skladu s pričakovanji. Po drugih razlagah naj bi kompleks agRNA/Ago2 po vezavi privlačil bodisi pozitivne transkripcijske faktorje, bodisi RNA polimerazo II, kar pa ni dokazano.

Vpliv tarče

Zanimivo pa je vprašanje, kaj odloča o tem, da neka molekula dsRNA deluje kot siRNA (utiša gen), druga pa kot saRNA (aktivira gen). Najverjetnejši odgovor se skriva v razlogu za samo odkritje RNAa. Li et al. so RNAa dosegli zgolj z izbiro druge tarče, tokrat izven GC bogate regije. Domnevo, da tarčna sekvenca odloča o efektu, so preizkusili Janowski et al. in potrdili, da v primeru gena za progesteronski receptor, razlika ene same baze (nukleotida) pri izbiri tarče na promotorju lahko pomeni razliko v efektu.

Pomen RNAa

RNAa ima izjemen potencial tako v raziskovalnem delu, kot pri zdravljenju. Tako kot se RNAi večkrat uporablja pri knockoutiranju genov, se lahko RNAa uporablja za induciranje prisotnosti nekega proteina ali povečanje njegove količine. V smislu zdravljenja so bili že sami začetki raziskovanja RNAa usmerjeni v boj proti raku prek aktivacije izražanja represorjev rasti v rakastih celicah. Še en primer je zdravljenje hiperholesterolemije z RNAa gena za LDL receptorje, ki znižajo nivo holesterola v krvi. Možnosti uporabe fenomena RNAa so torej praktično neomejene.

Viri

Li et al.  : Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells, Pnas 2006, vol.103, št. 46, str. 337-342

---

Chu et al.  : Involvement of argonaute proteins in gene silencing and activation by RNAs complementary to a non-coding transcript at the progesterone receptor promoter, Nucleic Acids Research 2010, vol.38, št. 21, str. 736-748

---

Shibuya et al.  : RNA-directed DNA methylation induces transcriptional activation in plants, Pnas 2009, vol.106, št. 5, str. 660-665

---

Matsui et al.  : Activation of LDL Receptor (LDLR) Expression by Small RNAs Complementary to a Noncoding Transcript that Overlaps the LDLR Promoter, Chem Biol. 2010, December, str. 344-355

---

Place et al.  : MicroRNA-373 induces expression of genes with complementary promoter sequences, Pnas 2008, vol.105, št. 5, str. 608-613

---