Virusi, ki jih uporabljamo pri genskem zdravljenju

Adenovirusni vektorji

Adenovirusni (Ad) vektorji so primerni predvsem za in vivo transdukcijo nedelečih se celic. Imajo 36 kb velik linearen dsDNA genom, ki se v jedru gostiteljske celice nahaja v obliki episoma, zaradi česar je podvržen procesom utišanja, pa tudi podvojuje se ne. Vnos vektorja je zato potrebno ponavljati. Prednost Ad-vektorjev je relativno enostavna in hitra namnožitev, glavna slabost pa je njihova patogenost, ki se ji je potrebno izogniti.

Priprava vektorjev

Adenovirusni genom vsebuje ti. zgodnje (E, early) in pozne gene. Najprej se prepiše regija E1, ki kodira za dva nujno potrebna proteina za virusno razmnoževanje: E1A, ki spodbuja prepis ostalih genov zgodnje faze, in E1B, ki zavira p53 in s tem preprečuje sprožitev apoptoze, preden bi nastali virioni. V odsotnosti genov E1 se virus ne more razmnoževati, kar omogoča konstrukcijo varnih vektorjev za gensko zdravljenje. Priprava konstruktov poteka v celični liniji, katere genom vsebuje regijo E1 (npr. HEK293).

Prva generacija Ad-vektorjev je v izogib imunogenosti vsebovala še delecijo regije E3 (ki za replikacijo sicer ni obvezna); vključiti je bilo mogoče do 8,2 kb DNA. Ker je prepis ostalih virusnih proteinov v manjši meri vseeno možen, vektorji zaradi proženja imunskega odziva niso bili učinkoviti. Druga generacija Ad-vektorjev vsebuje dodatno delecijo E2 ali E4. Insercijska kapaciteta znaša do 14 kb.

Najbolj izpopolnjena generacija Ad-vektorjev ima izbrisane vse virusne gene, tako zgodnje kot pozne (katerih produkt so strukturni proteini). Konstrukt vsebuje le signalno regijo za pakiranje (Ψ) in obrnjeni terminalni regiji (ITR). Razmnoževanje poteka ob pomoči pomožnega vektorja z delecijo E1, ki zagotavlja sintezo proteinov kapside. Na obeh koncih regije Ψ vsebuje pomožni vektor sekvenco loxP, zaradi česar se regija ob prisotnosti rekombinaze Cre (ki jo tudi mora izražati E1-celična linija), odstrani – virioni naj namreč vsebujejo le genom s transgenom. Ti Ad-vektorji so se izkazali za in vivo varne; omogočajo tudi vstavitev do kar 37 kb tuje DNA.

Tkivna specifičnost

Zahtevnejši del zdravljenja z Ad-vektorji je varna dostava do željenega tkiva. Adenovirusi se glede na serotip vežejo na različne receptorje epitelnih celic, ki se izražajo precej tkivno nespecifično. Interagirajo tudi s koagulacijskim faktorjem X, ki povzroči vezavo vektorja na hepatocite – le-te prestrežejo kar 80 % virusnih delcev iz sistemskega obtoka.

Učinkovitejše usmerjanje je moč doseči z modifikacijami proteinov kapside, npr. z genetsko zamenjavo domen, ključnih za interakcije z receptorjem. Najprimernejša je uporaba homolognih domen serotipov iste družine, saj večja sorodnost pomeni manjše tveganje za porušitev stabilnosti kapside. Specifični ligandi so lahko vgrajeni tudi v prokariontske viruse, katerih stopnja transdukcije sesalskih celic je sicer nizka. Uporaba nekovalentno vezanih adapterjev omogoča modifikacijo virusov, katerih struktura ni natančno znana. Na eni strani se adapter veže na ključno mesto virusnega proteina, na drugi strani pa na izbrani tkivno specifičen receptor. Ker obstaja nevarnost disociacije adapterja, je ta način uporaben za predklinične raziskave.

Bolj varna je kovalentna vezava adapterjev, npr. polietilenglikolnih (PEG) polimerov z vezanim ligandom. Plašč iz PEG deluje tudi kot zaščita pred celicami imunskega sistema in preprečuje vezavo vektorja na hepatocite.

Primer

V rakavih celicah se Ad-vektor zaradi motenega izražanja p53 lahko razmnožuje. Pride do celične lize, novi virusni delci okužijo sosednje rakave celice. Gendicin, ki je bil na Kitajskem uradno odobren leta 2003 in se uporablja za zdravljenje raka epitelnih celic vratu oz. glave, vsebuje gen za p53. Aktivno prepisovanje tega faktorja poveča stopnjo apoptoze, odstranjevanje tumorja pa dodatno pospešijo celice imunskega sistema, katerih odziv je v tem primeru zaželen. Gensko zdravljenje se uporablja v kombinaciji s kemo- in radioterapijo.

Vektorji z adenovirusi povezanih virusov (AAV)

AAV so virusi z ssDNA genomom dolžine 4,7 kb. Za replikacijo potrebujejo pomožni (adeno)virus, okužijo pa deleče ali nedeleče se celice. Za in vivo uporabo so primerni, ker so za človeka nepatogeni, imajo pa manjšo kapaciteto za vstavitev tuje DNA (do 5,2 kb). Prav tako je zahtevnejša priprava vektorjev za gensko terapijo.

Rekombinantni AAV-vektor vsebuje le obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR), medtem ko sta regiji rep in cap izbrisani. Zaradi modifikacij do integracije v gostiteljski genom ne pride, so pa episomalne konkatemere precej stabilne in se lahko izražajo še več let. Namnožitev AAV-vektorjev ob pomoči pomožnega vektorja z regijama rep in cap poteka v E1-celični liniji, za tkivno specifično usmerjanje pa so potrebne modifikacije kapside (ki je v primerjavi s kapsido adenovirusov precej enostavnejša).

Leta 2012 je bila v Evropi in ZDA odobrena Glybera, AAV-vektor z genom za lipoprotein lipazo. Ker je okvara tega gena izredno redka, zdravljenje pa predrago, je bila oktobra 2017 umaknjena s trga.

Decembra 2017 je FDA odobrila Luxturno: subretinalni vnos gena za retinoid-izomerohidrolazo omili slepoto pri dedni mrežnični distrofiji.

Viri

[1]

[2] C. Capasso, M. Garofalo, M. Hirvinen, V. Cerullo, The evolution of adenoviral vectors through genetic and chemical surface modifications, Viruses. 6 (2014) 832–855. doi:10.3390/v6020832.

[3] R. Waehler, S.J. Russell, D.T. Curiel, Engineering targeted viral vectors for gene therapy, 8 (2007) 573–587. doi:10.1038/nrg2141.

[4]

[5]