Avidin

Avidin

Avidin je tetrameričen protein proizveden v ptičjih jajcevodih, plazilci in doživke pa ga odlagajo v beljak njihovih jajc. V kokošjem jajcu avidin predstavlja približno 0,05% skupnih proteinov oziroma beljakovin beljaka(približno 1,8 mg na jajce). Tetrameričen protein vsebuje štiri enake podenote(homotetramere) od katerih se lahko vsaka veže na biotin( Vitamin B₇, vitamin H) z visoko afiniteto in specifičnostjo. Konstanta asociacije avidina je izmerjena na K_D ≈ 10^-15 M zaradi tega je ena od najmočnejših nekovalentnih vezi.

V svoji tetraedrični obliki je avidin izmerjen na približno 66-69 kDa velikosti. Deset odstotkov molekulske mase je posledica vsebnosti ogljikovih hidratov v sestavi od štirih do petih manoz in treh N-acetilglukozamidnih ostankov. Ogljikovi hidrati avidina vsebujejo najmanj tri edinstvene oligosaharidne strukturne vrste, ki so si podobne po strukturi in sestavi. Neglikozilirana oblika avidina je bila izolirana iz komercialno pripravljenega izdelka, vendar pa ni dokončna, ne-glikozilirana oblika se pojavlja v naravi ali pa je produkt proizvodnega procesa.

Odkritje Avidina

Avidin je prvič odkril Esmond Emerson Snell (1914-2003). Pot do odkritja se je začela z ugotovitvijo, da so piščanci na prehrani surovega beljaka bili v pomanjkanju biotina, kljub razpoložjivosti vitamina v svoji prehrani. Zato je bilo sklenjeno, da je sestavni del beljaka izoliran biotin, katerega je Snell preveril na vitro z uporabo kvasovk. Snell pozneje izolira sestavine jajčnega beljaka, odgovorne za vezavo biotina in v sodelovanju z Paul Gyorgy, sta potrdila, da je bil izoliran protein vzrok pomanjkanja biotina. Včasih je bilo pogojno ime proteina avidalbumin (dobesedno, lačni albumin). Ime proteina je bilo kasneje spremenjeno na Avidin, zaradi njegove sorodnosti z biotinom.

Uporaba Avidina

Raziskava leta 1970 je pomagala osnovati Avidin-biotinski sistem, kot močno orodje bioloških ved. Zavedajoč se moči in specifičnosti Avidin-biotin kompleksa, so raziskovalci začeli izkoriščati Avidin kot sondo in afiniteto matrike v številnih raziskovalnih projektih. Kmalu zatem, sta raziskovalca Bayer in Wilchek razvila nove metode in reagente za biotinilatna protitelesa in druge biomolekule, ki omogočajo prenos Avidin-biotinskega sistema na različne biotehnološke procesih. Danes se avidin uporablja v različnih procesih, od raziskav do diagnostike z medicinskimi in farmacevtskimi pripomočki. Sorodnost avidina do biotina se izkorišča v obsežnih biokemičnih testih, vključno z Western blot, ELISA in ELISPOT. Avidin imobiliziran na trden podpornik se uporablja tudi kot prečiščevalni medij, ki ujame biotinsko označene beljakovine ali molekule nukleinske kisline.

Spremenjene oblike Avidina

Kot v osnovi nabit glikoprotein, avidin kaže nespecifično vezavo na nekatere oblike. Neutravidin, deglikoliziran avidin z modificiranim argininom, kaže bolj nevtralno pI in je na voljo kot alternativa naravnemu avidinu, v katerem problemi neobičajnega spajanja nastanejo. Deglikolizirane, nevtralne oblike avidin so na voljo prek Sigma-Aldrich (Extravidin), Thermo Scientific (NeutrAvidin), Invitrogen (NeutrAvidin), in Belovo (NeutraLite). Glede na moč avidin-biotinske vezi, razkroj avidin-biotin kompleksa zahteva ekstremne pogoje, ki povzročajo denaturacijo beljakovin. Nereverzibilna lastnost avidin-biotin kompleksa lahko omeji oblike avidina za uporabo v afiniteti kromatografije, kjer je izpustitev ujetih ligand zaželeno. Raziskovalci so ustvarili avidin z reverzibilno vezavo, z lastnostmi nitriranja ali iodiniziranja zavezujočega tirozinega mesta. Spremenjeni avidin pokaže močne biotinsko vezne značilnosti pri pH 4 in sprošča biotin pri pH 10 ali več. Monomerne oblike avidina z zreducirano afiniteto napram biotinu se uporabljajo tudi v številnih komercialno dostopnih afinitetah smole. Monomerni avidin nastane z obdelavo imobiliziranega naravnega avidina s pomočjo sečnine ali gvanidinijeve HCl (6-8M), ki je nižja disociacija K_D ≈ 10^-7M. To omogoča izpiranje iz matrike avidina, da nastane pri milejših, nedenaturiranih pogojih, z uporabo nizkih koncentracij biotina ali nizkih pH pogojev.

Slike

[Beljak kokošjih jajc: http://www.mahi.in/images/weight_loss/Egg_Whites.JPG]
Avidin-biotin struktura [1]
Avidin [2]
Biotin [3]

Viri

   * http://en.wikipedia.org/wiki/Avidin
   * http://www.worthington-biochem.com/AV/default.html
   * http://www.bio.davidson.edu/courses/GENOMICS/method/biotin_avidin.html#
   * Angerer, L. et al., (1976) An electron microscope study of the relative positions of the 4S and ribosomal RNA genes in HeLa cells mitochondrial DNA. Cell. 9, 81-90.
   * Bayer, EA. et al., (1985). 3-(N-Maleimido-propionyl)biocytin: a versatile thiol-specific biotinylating reagent. Anal. Biochem., 149, 529-536.
   * Bayer, EA., et al., (1976) Preparation of ferritin-avidin conjugates by reductive alkylation for use in electron microscopic cytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 24, 933-939.
   * Bruch, R. & White, H. (1982). Compositional and structural heterogeneity of Avidin glycopeptides. Biochemistry, 21, 5334-5341.
   * Eakin, E. et al., (1940). Egg-white injury in chicks and its relationship to a deficiency of vitamin H (biotin). Science, 92, 224
   * Green, N. (1963). The Use of [14C] Biotin for Kinetic Studies and for Assay. Biochem J, 89, 585-591
   * Green, N. (1975). "Avidin," Advances in Protein Chemistry 29, 85-133.
   * Gyorgy, P. (1941). Egg-white injury as the result of non-absorption or inactivation of biotin. Science, 93, 477-478.
   * Heggeness, MH. & Ash, JF. (1977) Use of the Avidin-biotin complex for the localization of actin and myosin with fluorescence microscopy. J. Cell. Biol. 73, 783-788.
   * Hiller., Y et al., (1987). Biotin binding to avidin. Biochem. J., 248, 167-171.
   * Hofmann, K., & Kiso, Y. (1976) An approach to the targeted attachment of peptides and proteins to solid supports. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 3516-3518.
   * Kohanski, R & Lane, M. (1990) Methods in Enzymology. 184, 194.
   * Korpela, J. (1984). Avidin, a high affinity biotin-binding protein as a tool and subject of biological research. Med. Bio. 62, 5-26.
   * Kresge, N. et al., (2004). The Discovery of Avidin by Esmond E. Snell. J. Bio. Chem. 279, e5
   * Morag, E. et al., (1996) Reversibility of biotin-binding by selective modification of tyrosine in Avidin. Biochem. J. 316, 193-199.
   * Snell, E. et al., (1940). A quantitative test for biotin and observations regarding its occurrence and properties. J. Am. Chem. Soc., 62, 175-178.
   * Wilchek, M. et al., (1986). p-Diazobenzoyl biocytin—a new biotinylating reagent for the labeling of tyrosines and histidines in proteins. Biochem. Biophys. Res. Commun. 138, 872-879.