Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom (Srna Anastasovska, Mateja Milosevic)
Uvod
Koronavirusi imajo eden od največjih enoverižnih RNA genoma, pri RNA virusih. Gen 1, ki je najbolj na 5’ koncu zaseda dve tretjini genoma in je izgrajen iz dva bralna okvira - ORF 1a in ORF 1b, ki se po okužbi translatirata v prekurzorne poliproteine, ki se nadalje procesirajo v proteinaze in nestrukturne proteine. Večina nestrukturnih proteinov je pomembna pri replikaciji in transkripciji virusa. V tem seminarju opisujemo nestrukturni protein 1 – nsp1
Z raziskavo motifov in domen nsp1 pri α-koronavirusih, je odkrit β-sodček, ki ga obdaja α-vijačnica skupaj s številnimi aminokislinskimi ostanki, ki tvorijo hidrofobno jedro β-sodčka, kar nam opisuje strukturo proteina. Iz strukture ni odkrita ohranjena struktura, ki bi razložila funkcijo α-CoV-nsp1. Analizom celic okuženih z α-koronavirusih je ugotovljeno izražanje virusa v nukleusu in citoplazmi ledvičnih celic pri človeku. V sesalskih celicah, nsp1 inhibira: ekspesijo reporter genov katere tudi kontrolirajo konstitutivni promotorji in inducirajoči promotorji genov imunskega odziva, ekspresijo od SV40 – promotor – odvisnega reporter gena, kar podpira replikacijo virusa, inhibira tudi sintezo proteinov gostitelja, pri tem ne vplivajoči na stabilnost gostiteljske mRNA in v in-vitro sistemih inhibira translacijo različnih reporter genov. Mehanizmi inhibicije ekspresije reporter genov, inhibicje sinteze proteinov in translacije mRNA gostitelja od strane α-CoV-nsp1 niso še pojasnjeni. Nekaj je namigov da je več tipov α-CoV-nsp1 proteinov povezano z ribozomalnim proteinom S6, ki je lociran na vezavnem mestu za mRNA 40s podenote ribosoma in predstavlja centralno komponento translacijskega stroja celice.
Pri β-koronavirusih poznamo 4 roda – A, B, C, D , kjer so značilni virusi – pri A: mišji hepatitis virus (MHV) in goveji koronavirus (BCoV) in v rodu B: SARS-CoV. Nsp1 se pri MHV in BCoV virusih sprošča s procesiranjem ORF1a na N-koncu z papain podobno proteinazo in je lokaliziran izključno v citoplazmi okuženih celic. Raziskave, ki so se ukvarjale z biološkimi funkcijami nsp1 so ugotovile da se pri okužbi z MHV-jem v sesalskih celicah, nsp1 izraža tako da inhibira proliferacijo celic in zaustavlja celični cikel v G0/G1 fazi. Podobno kot pri α-koronavirusih, nsp1 inhibira ekspresijo reporter genov, pod kontrolom različnih promotorjev. Dodatno, z delecijo regije na C-koncu nsp1 se odkloni sposobnost inhibicije ekspresije reporter genov, kar ukazuje na pomembnost tiste regije. V dodatnih raziskavah so odkrili da nsp1 sodeluje pri bolj efikasni replikaciji virusa MHV tako da nasprotuje sistemu interferonov (IFN), kar so ugotovili tako, da so oslabljen virus MHV, katerem so genu v kodirajoči regiji odklonili 99 nukleotidov in inokulirali v miših s pomanjkanjem IFN receptorja. Nivoji replikacije oslabljenega virusa so bili približni kot bi bili pri okužbi z divjim tipom MHV-ja. V tej raziskavi je tudi odkrito da so mišji, okuženi z oslabljenim virusom bili bolj zaščiteni pred divjim sevom enakega virusa, kar je ukazovalo na mogoč potencial za razvijanje cepiva. Mehanizmi inhibicije ekspresije genov gostitelja z MHV nsp1 in tudi njegove interakcije z sistemom interferonov niso še odkriti.
Mutacije kodirajočih regij MHV nsp1 identificira dve domeni nsp1, ki sta pomembni za replikacijo virusa. Delecije na N-koncu so bile smrtonosne za virus in so bile pomembne za replikacijo virusa. Mutacije na C-koncu, ki naj ne bi spremenile mesto za papainu podobno proteinazo, ki je pomembno pri sproščanju nsp1 iz ORF1a poliproteina, niso imele značilnega vpliva na replikacijo virusa. Vloga nsp1 pri replikaciji MHV virusa je nakazana v tem da je najden v kompleksih proteinov, ki nastajajo pri replikaciji virusa in v njegovi interakciji z nsp7, nsp 10, nsp 12 (RNA polimeraza) in nsp13 (helikaza), ki sta kritična proteina pri regulaciji sinteze virusne RNA, ki tudi izhajata iz ORF1a poliproteina. V okuženih celicah je nsp1 lokaliziran v celični membrani. Pri BcoV se nsp1 veže na RNA in interagira s cis replikacijskimi elementi 5’-UTR regijo BcoV genoma, kar potencialno ukazuje na pomembno vlogo pri regulaciji translacije ali replikacije. V obeh BcoV in MHV je odkrita RNA-RNA interakcija med 5’UTR regijo in kodirajočo regijo nsp1 proteina, ampak z dodatno raziskavo se je ugotovilo da ni nujna pri replikaciji, ampak je značilna ker pospešuje proces replikacije pri SARS-CoV virusu.
Inhibicija ekspresije genov v SARS-CoV-u
V SARS-CoV-u, nsp1 protein je eden od najbolj tipičnih primerov tega proteina. Mehanizem inhibicije ekspresije genov je opisan v dveh korakih, kjer v prvi fazi protein napada proces translacije in vpliva na stabilnost celične mRNA. Nsp1 inhibira translacijo mRNA in inducira endonukleolitični razcep RNA na 5’-neprevedenoj regiji (5’-UTR). Rezultat je pospešena razgradnja mRNA s celično XRN-1 posredovano 5’-3’ eksonukleolitično potjo. SARS-Cov nsp1 se vezuje na 40S podenoto in tako inaktivira ribosom za translacijo in lahko pristopa do translacijskega stroja ribosoma. Mutaciji K164A in H165A v C-končni regiji onemogočita nsp1 v teh dejavnostih, kar ukazuje na povezanost tistih delov proteina z 40S podenoto. SARS-CoV nsp1 ne vsebuje endonukleazne aktivnosti in se predpostavlja da rekrutira dodatno endonukleazo kako bi inducirala cepitev mRNA. V in-vitro sistemih SARS-Cov nsp1 inducira cepitev RNA na 5’-UTR. Zanimivo je da SARS-Cov nsp1 nima kot tarčo specifično zaporedje nukleotidov za substrat. SARS-Cov nsp1 tudi blokira aktivacijo od-IFN-odvisnih genov, tako da inhibira od-IFN-odvisno signalno pot. Ugotovljene so mutacije R124S in K125E, ki značilno vplivajo na možnost SARS-Cov nsp1 pri inhibiranju signalnih poteh.
Nsp1 inhibira translacijo pri virusu
V eni in-vitro raziskavi SARS-CoV virusa je odkrito da nsp1 protein virusa vpliva tudi na translacijo virusne mRNA v okuženih celicah, tako da je upočasni. V iniciacijski fazi translacije virusne mRNA nsp1 blokira pretvorbo 40S podenote ribosoma v funkcionalni 80S kompleks. Nsp1, čeprav inducira endonukleolitično cepitev mRNA gostitelja, ne cepi virusno mRNA, zaradi ’zaščitnega’ zaporedja na 5’- koncu, ki je na splošno pogosta v virusih. Ker je inhibicija virusne translacije kontraintuitivno, ugotovilo se je da velja, ampak v nasprotju s tem nivoji replikacije virusa še vedno ostanejo na optimalnem nivoju. Količina nsp1 ni tako velika da bi inhibirala sintezo replikaza.
Viri
1. Narayanan, Krishna, et al. "Coronavirus nonstructural protein 1: Common and distinct functions in the regulation of host and viral gene expression." Virus research 202 (2015): 89-100.
2. Huang, Cheng, et al. "SARS coronavirus nsp1 protein induces template-dependent endonucleolytic cleavage of mRNAs: viral mRNAs are resistant to nsp1-induced RNA cleavage." PLoS Pathog 7.12 (2011): e1002433.
