Struktura in mehanizem restriktaz tipa II

Uvod

Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo.

Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.

Restriktaze tipa II

Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg²⁺, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.

Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. EcoRI in RsrI: G|AATTC).

Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.

• Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so EcoRI, EcoRV in BglI. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve.

• Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP.

• Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti.

• Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je FokI. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.

• Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja.

• Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je DpnI.

Struktura

Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze EcoRI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.

V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki, ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS FokI). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).

S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD-D/EXK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze, MutH, RecB endonukleaze, VSR endonukleaze in T7 nukleazo I. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama [3]. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (ang. Structural Classification of Proteins) klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (ang. R Ease-like fold). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP EcoRI in EcoRV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom , zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi .

Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg²⁺. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca²⁺. Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za EcoRV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.

Mehanizem

Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere nad 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.

Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene.

Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II sodelujeta pri vezavi na DNA in njeni cepitvi. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati.

Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2^-. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg²⁺. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.

Viri in literatura

• Labrie, S. J. et. al. Bacteriophage resistance mechanisms. Nature Reviews Microbiology, 2010, let. 8, str. 317-327.