Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave

Endolizini so pestra družina encimov, zapisanih v bakteriofagnem genomu. Izrazijo se znotraj gostiteljske celice na koncu bakteriofagnega litičnega cikla, ko razgradijo bakterijsko peptidoglikansko steno (PG). To povzroči lizo celice in sprostitev na novo ustvarjenih bakteriofagov v okolico.

Naravno antibiotično funkcijo endolizinov lahko s pridom uporabimo pri sintezi encimskih antibiotikov, ki so zaradi svojega načina delovanja hitrejši in bolj specifični od standardnih antibiotikov. Poleg tega je možnost nastanka rezistence na njih majhna, saj cepijo konservativne peptidoglikanske vezi, ki jih bakterija težje spremeni, ob tem pa jim ni potrebno niti vstopiti v celico. Čeprav so endolizini perspektivni, pa je prostora za izboljšave še veliko. S pomočjo različnih bioinženirskih modifikacij se znanstveniki trudijo optimizirati njihovo delovanje v fizioloških pogojih (npr. topnost, obstojnost v krvni plazmi, aktivnost pri fiziološkem pH, specifičnost…) Na začetku je bila eksogena uporaba endolizinov možna le na Grampozitivnih bakterijah, z leti raziskav in modifikacij pa so delovanje nekaterih uspeli razširiti tudi na Gramnegativne.

Delitev endolizinov

Struktura

Po strukturi jih delimo na enodomenske globularne, ki so bolj značilni za Gramnegativne bakterije, in dvodomenske modularne, ki se pojavijo pri obeh tipih. V modularnih je N-končna encimsko aktivna domena (EAD) s kratko, fleksibilno verigo povezana s C-končno, ki je specifična za vezavo na celično steno (CBD). Zaradi take strukture modularni endolizini predstavljajo večji potencial za bioinženirske izboljšave, saj se posamezni domeni lahko obravnava ločeno ter se ju lahko neodvisno spreminja (npr. točkovna mutacija), doda ali odstrani, s čimer nastane protein z novo ali izboljšano funkcijo. V modularnih endolizinih, ki delujejo na Gramnegativne bakterije (slednji so sicer redki), pa sta domeni zamenjani. Čeprav je CBD specifična za vezavo na PG, pa njena prisotnost za delovanje endolizina ni vedno ključna. V nekaterih primerih njihova aktivnost ob odstranitvi CBD ni nič slabša ali je celo povečana.

Katalitska zmožnost

Endolizini se delijo tudi glede na katalitske zmožnosti. Peptidoglikanska stena je sestavljena iz ponavljajočih se enot N-acetilglukozamina in N-acetilmuraminske kisline, ki so med sabo povezane z β-(1,4)-glikozidno vezjo. To vez cepijo N-acetilglikozidaze. Na N-acetilmuraminsko kislino je z amidno vezjo pripeta peptidna veriga iz 3-5 aminokislin, posamezne verige pa so med seboj tudi navzkrižno povezane. Amidno vez cepijo N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze, peptidno vez med aminokislinami in posameznimi peptidnimi verigami pa endopeptidaze.

N-acetilglikozidaze

N-acetilmuramidaze

N-acetilmuramidaze, ki delujejo na Grampozitivne bakterije, spadajo v družino glikozidnih hidrolaz 25. Vez cepijo na reducirajočem koncu N-acetilmuraminske kisline po enem izmed dveh predlaganih mehanizmov. Pri prvem so za katalizo ključni trije aspartati in en glutamat. Najprej Asp deprotonira molekulo vode, ki nato kot nukleofil napade β-1,4 vez. Istočasno Glu donira svoj proton, tako da pride do inverzije anomernega centra. Preko preostalih dveh Asp se katalitsko mesto regenerira. Pri drugem mehanizmu sta ključna aminokislinska ostanka le Asp in Glu. Asp veže substrat, v katerem pride do intramolekularnega nukleofilnega napada N-acetoamidne stranske skupine na β-1,4 vez. Nato Glu deprotonira molekulo vode, ki nukleofilno napade anomerni C atom, vendar tako, da se anomerni center ohrani.

Izboljšave

N-acetilmuramidaze imajo velik potencial za bioinženirsko izboljšavo. Dober primer sta za pnevmokoke specifična Cpl-1 in Cpl-7. Cpl-7 ima zelo aktivno EAD, vendar ima kljub temu nižjo bakteriolitično zmožnost kot Cpl-1. Razlog za to je bolj negativen neto naboj Cpl-7 pri fiziološkem pH kot pri Cpl-1. Z zamenjavo 5 aminokislin so neto naboj spremenili na pozitiven ter ustvarili spremenjen encim Cpl-7S, ki je kazal izboljšano bakteriolitično zmožnost proti pnevmokokom in nekaterim drugim bakterijam. S kombinacijo CBD iz Cpl-1 in EAD iz Cpl-7 so ustvarili himerolizin Cpl-711 z izboljšanimi bakteriolitičnimi značilnosti v primerjavi s starševskima endolizinoma. Z bioinženirsko metodo pa se ne trudijo le povečati bakteriolitične funkcije enzobiotikov, pač pa tudi podaljšati njihovo življenjsko dobo v krvni plazmi. Iz tam so namreč majhni proteini zaradi delovanja ledvic hitro izločeni. V ta namen so v posamezni monomer Cpl-1 vpeljali cisteine, ki so nato med seboj tvorili intermolekularne disulfidne vezi. Nastali Cpl-1 dimer je poleg podaljšane življenjske dobe v krvni plazmi kazal tudi dvakrat večjo specifičnost.

Litične transglikozilaze

Litične transglikozilaze tako kot N-acetilmuramidaze cepijo β-1,4 vez med N-acetilglukozaminom in N-acetilmuraminsko kislino, pri čemer nastane 1,6-anhidromuramoil, vendar z razliko, da za delovanje ne potrebujejo vode. Edini endolizin iz tega razreda, ki so ga uspeli kristalizirati in potrditi njegovo katalitično funkcijo je Gp144 (deluje na Pseudomonas aeruginoso). Prav tako je eden izmed redkih, ki deluje na Gram negativne bakterije. Endolizin v raztopini obstaja v različnih oligomernih oblikah, in sicer kot mono-, di- in trimer. V cepitev vezi je vpleten Glu115, vendar rezultati več raziskav kažejo, da je vpleten tudi Glu178.

Izboljšave

Pri Gram pozitivnih bakterijah se je izkazalo, da se ta aktivnost izgubi, saj te O-acetilirajo peptidoglikan na tisti stranski skupini, ki je vključena v nastanek 1,6-anhidromuramoila. Prav tako je bilo dokazano, da je pri tej vrsti bakterij interakcija encima s peptidoglikanom oslabljena. Delovanje na Gram pozitivne bakterije, ki nimajo zaestrenih skupin, in Gram negativne bi lahko izboljšali, če bi poznali natančne mehanizme vezave, da bi te lahko izboljšali. Pri modificiranju encima bi bilo potrebno paziti, da modifikacije ne bi vplivale na procese, ki so povezane z oligomerizacijo.

N-acetilglukozaminidaze

Edini strukturno znan endolizin z aktivnostjo N-acetilglukozaminidaze, ki cepi vez za N-acetilglukozaminom je PlyC. Encim je kompleks, sestavljen iz ene velike podenote in homooktamernega obroča. Na veliki podenoti se nahajata obe do sedaj identificirani encimsko aktivni domeni: od cisteina in histidina odvisna amidohidrolazna/peptidazna domena (PlyCCHAP) in N-acetilglukozaminidazna domena (PlyCGyH). Jedro PlyCGyH sestavlja struktura iz šestih α-heliksov, podobno kot pri nekaterih proteinih družine glikozidnih hidrolaz 73 (GH73). Znotraj omenjene regije je ohranjen aminokislinski ostanek Glu78, ki pri reakciji deluje kot kislina. Pri nekaterih encimih iz družine GH73, so bili opaženi možni katalitični aminokislinski ostanki na β-traku nasproti aktivnega mesta, ki pa v primeru PlyC ne obstaja. Zaradi odsotnosti kislih ostankov je verjetno v mehanizmu pozicioniranja in cepitve vezi vključen Tyr74.

Izboljšave

Endolizin se je izkazal za učinkovitega, vendar izgubi svojo aktivnost že pri 45˚C, za kar je odgovorna velika podenota, vendar se da z uvedbo mutacij termično stabilnost močno povečati. Za razvoj modificiranih encimov, ki bi delovali na več vrst bakterij, bi rabili več znanih encimov, da bi lahko preučili mehanizme delovanja.

N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze

N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze cepijo amidno vez med N-acetilmuraminsko kislino in L-alaninom. V družino od cinka odvisnih amidaz 2 sodijo PlyL, PlyG, XlyA in LysGH15, ki imajo podobno strukturo in ohranjenost katalitičih ostankov. Zn-ion je koordiniran med molekulo vode, dvema histidinskima in enim cisteinskim ostankom. Pomembna ostanka sta glutamat, ki aktivira vodo za nukleofilni napad, in lizin, ki stabilizira intermediat. Znani sta dve amidazi PlyPSA in CD27L, ki spadata v skupino od cinka odvisnih amidaz 3. Endolizine te skupine sestavlja β-ploskev iz šest trakov, ki jih obdaja pet α-vijačnic. Zn-ion je koordiniran v vezavnem žepu z dvema histidinskima in enim glutamatskim ostankom. Ohranjena glutamatska ostanka med reakcijo delujeta kot akceptorja protona.

Izboljšave

Za namen reguliranja litične aktivnosti je možno skrajšati encim na le encimsko domeno z odstranitvijo vezavne domene, kar vodi do povečanja ali zmanjšanja aktivnosti. Učinki krajšanja endolizinov pri skupini amidaz 2 se razlikujejo, in sicer se lahko litična aktivnost ohrani ali izgubi. Z uvajanjem pozitivno nabitih aminokislin, se da aktivnost povrniti, vendar je ključno, da se te uvedejo okoli aktivnega mesta. Domnevno naj bi skupen pozitiven naboj endolizina ugodno vplival na interakcije s peptidoglikanom. Krajšanje endolizina pri amidazah 3 je imelo ponovno učinke na zmanjšanje in zvečanje aktivnosti. To kaže na nepoznavanje interakcij med encimsko in aktivno domeno pri različnih endolizinih. Boljše razumevanje strukture in delovanja endolizinov iz skupine amidaz 3 bi olajšalo modifikacije le-teh.

Endopeptidaze

Endopeptidaze cepijo peptidne vezi med aminokislinami, ki tvorijo polipeptidne verige in interpeptidni most. Raznolikost ostankov, ki tvorijo peptidoglikanske polipeptidne verige in interpeptidni most, kažejo na to, da gre verjetno za raznoliko skupino endolizinov z različnimi mehanizmi, ki ustrezajo različnim vezem. Ta razred endolizinov je zelo slabo razumljen - obstaja samo ena rešena struktura endolizina z endopeptidazno aktivnostjo, Ply500. Encimsko aktivna domena Ply500 za katalizo potrebuje cinkov ion, njena struktura pa spominja na kavč: ena α-vijačnica in tri antiparalelni β-trakovi tvorijo sedež, ki ga podpirata dve α-vijačnici, še ena α-vijačnica skupaj z zanko pa tvori naslonjalo.

Kot večina drugih endolizinov ima tudi Ply500 modularno strukturo, sestavljeno iz domene, ki veže celično steno in encimsko aktivno domeno. Opažena je bila jasna strukturna podobnost s peptidazami, ki spadajo v družino LAS. Njihovo skupno funkcionalno podobnost podpirata skupen vezani Zn2+ ion in aminokislinski ostanki His80, Asp87 in His133 na aktivnem mestu. Dejstvo, da je CBD Ply500 homologen CBD faga Listerie N-acetilmuramoil-1-alanin amidaze PlyPSA, ki ima popolnoma drugačen EAD, ponazarja funkcionalno spremenljivost tega razreda encimov in odpira zanimive možnosti za proteinski inženiring. Na žalost poskusi pridobivanja kristalov celotnega rekombinantnega encima Ply500 niso uspeli, verjetno zaradi prirojene prožnosti njegove arhitekture z dvema domenoma. Najdemo pa tudi variacije znotraj predlaganih katalitičnih ostankov. Cinkov ion je koordiniran z ohranjenimi ostanki His80, Asp87 in His132 in molekulo vode, pri čemer je Asp130 aktivira molekulo vode za nukleofilni napad. Drugi ključni ostanki bi lahko bili Arg50 in Gln55 za stabilizacijo oksianionskega intermediata. Poleg Ply500 pa imamo zelo omejeno mehanično razumevanje te potencialno obsežne skupine endolizinov.

Izboljšave

Da bi izboljšali delovanje Ply500, so v eni izmed študij kombinirali njegov CBD s PlyP35, kar je povzročilo 50-kratno povečanje afinitete vezave na celično steno (KA = 2,93 × 1010 M-1), kar omogoča visoko učinkovito imobilizacijo tarčnih celic. Pokazali so tudi, da se lahko afiniteto vezave še poveča s povečanjem kopij istega CBD-ja v enem fuzijskem konstruktu. Poleg tega povečana afiniteta do celične stene verjetno povzroči močnejšo vezavo pri visoki ionski jakosti, kar pojasnjuje opažanje, da je Ply500 endolizin z podvojenim CBD pokazal povečano aktivnost pri povišanih koncentracijah soli. V določenih primerih lahko modularni inženiring endolizinov rešuje tudi težave z topnostjo, kar zagotavlja učinkovito proizvodnjo in čiščenje sicer netopnih litičnih proteinov.

CHAP

Struktura encimsko aktivnih domen endolizina je odvisna od cepljene peptidoglikanske vezi. Vendar pa ima en razred encimsko aktivnih domen, cistein histidinsko odvisna domena amidohidrolaze/peptidaze (CHAP - cysteine histidine-dependent amidohydrolase/peptidase), lahko amidazno ali endopeptidazno aktivnost. CHAP domena ima lahko tudi obe aktivnosti v enem polipeptidu, kar lahko opazimo v PlyGRCS. Žal struktura tega endolizina še ni bila rešena, zato molekularni mehanizem dvojne aktivnosti ostaja neznan. Značilnost CHAP endolizinov sta ostanka cistein in histidin, kjer stranska veriga cisteina verjetno deluje kot nukleofil, ki ga aktivira histidin. Kako so podobna endolizinska zvitja sposobna cepiti različne vezi, ni povsem jasno, vendar ima možnost vključitve dvojne aktivnosti, kot je razvidno iz PlyGRCS, v eno aktivno domeno CHAP zanimiv potencial za antibakterijsko uporabo.

Viri

Love, M. J., Abeysekera, G. S., Muscroft-Taylor, A. C., Billington, C. & Dobson, R. C. J. On the catalytic mechanism of bacteriophage endolysins: Opportunities for engineering. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics vol. 1868 140302 (2020).

São-José, C. Engineering of phage-derived lytic enzymes: Improving their potential as antimicrobials. Antibiotics vol. 7 (2018).

Korndörfer, I. P., Kanitz, A., Danzer, J., Zimmer, M., Loessner, M. J., & Skerra, A. (2008). Structural analysis of the L-alanoyl-D-glutamate endopeptidase domain of Listeria bacteriophage endolysin Ply500 reveals a new member of the LAS peptidase family. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, 64(6), 644–650. doi: 10.1107/s0907444908007890

Gerstmans, H., Criel, B. & Briers, Y. Synthetic biology of modular endolysins. Biotechnol. Adv. 36, 624–640 (2018).