Mehanizem celične smrti po delovanju antibiotikov

Uvod

Kot odziv na učinke antibiotikov so mikrobi razvili genetske in biokemijske poti za rezistenco na večino dolgo uporabljenih antimikrobnih sredstev. Edini način s katerim se bomo lahko še naprej zanašali na zdravljenje z antibiotiki je prek stalnih prizadevanj za odkrivanje novih antimikrobnih učinkovin in opredeliti nove genetske in biokemijske poti, ki vodijo v smrt celice.

Toksin-antitoksin sistemi

V bakteriji je ena najbolj raziskanih oblik programirane celične smrti posredovana preko specifičnih genskih modulov imenovanih moduli odvisnosti ali toksin-antitoksin sistemi (TA). Vsak modul je sestavljen iz para genov, ki določata dve komponenti. Drugi gen kodira stabilni toksin, prvi gen pa kodira labilni antitoksin, ki ovira delovanje toksina. TA sistemi so bili odkriti predvsem v bakterijah Escherichia coli na plazmidih z nizkim številom kopij in še nekaterih drugih ekstra-kromosomskih. Genetske enote toksina in antitoksina so poimenovali moduli odvisnosti, ker so celice odvisne od kratko obstoječega produkta, saj se labilni antitoksin razgradi hitreje kot stabilni toksin, njihova sinteza de novo pa je ključna za preživetje tovrstnih celic. TA sistemi, od katerih so nekateri homologni ekstra-kromosomskim modulom odvisnosti se pojavljajo tudi v kromosomu bakterije E. coli in številnih drugih bakterij. Prvi modul na bakterijskem kromosomu, opisan kot reguliran in odgovoren za PCS je mazEF modul, ki spada pod TA sistem tipa II. Toksin-antitoksin sistem mazEF je bil dokazan kot prisoten in funkcionalen v sevih MC4100 in MG1655. Gena mazE in mazF sta kromosomska gena, ki sta del rel operona bakterije E. coli. Gen mazE je lociran pred genom mazF, pod skupnim promotorjem. Na operonu bakterije E. coli seva MC4100 so trije promotorji; P1, P2 in P3, ki so bili identificirani pred genom mazE. Proteinska produkta MazE and MazF tvorita kompleks, ki inhibira transkripcijo genov promotorjev P2 in P3 in tako zagotavlja avto-regulacijo transkripcije. Koncentracija antitoksina glede na koncentracijo toksina je limitni faktor pri vklopu in izklopu operona. Natančneje rel operon bakterije E. coli sestoji iz štirih genov relA, mazE, mazF in mazG. Transkripcija z P2 in P3 promotorjev vodi do produkcije MazEF mRNA in translacija proizvaja MazE in MazF proteinske produkte. MazE in MazF tvori kompleks v 4:2 stehiometriji. Kompleks zavira nadaljnjo transkripcijo teh genov. MazE je konstitutivno cepljen s ClpAP in sproščen MazF cepi RNA, kar vodi do celične smrti.

Antibiotični zaviralci transkripcije in/ali translacije

Antibiotiki, ki inhibirajo transkripcijo in/ali translacijo, škodljivo vplivajo preko indukcije mazEF-posredovane PCD na celico. Zmanjšana stopnja transkripcije in translacije zmanjša količino MazE. To bo skupaj z dejstvom, da je MazE razgrajen z celičnimi proteazami, vodilo do povečanja koncentracije prostega MazF. Najprej so testirali učinke na sistemu številnih antibiotikov, vključno z rifampicinom, kloramfenikolom in spektinomicinom. V nemutiranih verzijah genov je bilo ugotovljeno, da že kratko inhibiranje transkripcije ali translacije z temi antibiotiki, zadostuje za sprožitev mazEF-posredovane smrti. Nasprotno izbris mazEF iz bakterijskega kromosoma prepreči celično smrt v prisotnosti antibiotikov. Treba je opozoriti na to, da je bila od mazEF odvisna bakteriocidnost opažena pri kloramfenikolu in spektomicinu, ko so celice rastle na minimalnem nebogatem mediju. Tako vidimo, da je bakteriocidnost teh dveh antibiotikov odvisna od okoljskih pogojev.

ROS odvisna/neodvisna celična smrt

Kasneje je bilo ugotovljeno, da ti antibiotiki, ki vplivajo na transkripcijo in translacijo povzročijo ROS odvisno celično smrt, posredovano z mazEF sistemom, medtem ko ti, ki povzročijo poškodbe DNA inducirane celične smrti (npr. kinoloni) pa po ROS neodvisni poti. Poleg tega so popolni anaerobni pogoji preprečili smrt posredovano z antibiotiki, ki inhibirajo transkripcijo in translacijo, ne pa smrti povzročene z antibiotiki, ki povzročijo DNA poškodbe. Dodajanje EDF-ja je povečalo tako za ROS odvisno mazEF- posredovano celično smrt za rifampicin kot tudi za ROS-neodvisno mazEF-posredovano celično smrt za nalidiksinske kisline-antibiotike, ki poškodujejo DNA. Pri tvorjenju PCD z reaktivnimi kisikovimi spojinami (ROS) proces zahteva prisotnost zunajceličnega smrtnega faktorja (EDF). Ta način delovanja nakazuje, da uporaba sintetičnega EDF skupaj z kinoloni, lahko poveča učinkovitost ubijanja bakterij. Poleg tega se lahko bakteriostatični antibiotiki pretvorijo v baktericidne z uporabo EDF za vključitev mazEF sistema. Neka druga skupina raziskovalcev je z merjenjem povečanja fluorescence HPF (hidroksifenil fluorescein) dokazala, da ROS niso bile nujno prisotne in verjetno tudi neodgovorne za ubijanje z antibiotiki, ker ni bilo razlike v preživetju celic, ko je bila E.Coli tretirana v aerobnih in anaerobnih pogojih. Različni avtorji so torej poročali o različnih rezultatih, ki so se med sabo izključevali.

Timinsko stradanje

Nedavno je bila odkrita nova skupina antibiotikov, ki prav tako sproži z mazEF programirano celično smrt. Predstavnika te skupine sta med drugim tudi trimetoprim in sulfonamid, ki povzročita t.i. timinsko stradanje zaradi česar nastopi t.i. smrt brez timina. Smrt brez timina je zanimiva tudi z vidika, da je pomanjkanje timina za celico baktericidno, medtem, ko je pomanjkanje ostalih rastnih faktorjev zgolj bakteriostatično. Kljub intenzivnemu preučevanju v zadnjih petdesetih letih pa mehanizem še vedno obstaja nerazjasnjen. Timinsko stradanje lahko v E. coli sprožimo tako, da inhibiramo sintezo timidilata neposredno ali pa posredno preko folatnega metabolizma, saj sta ti dve metabolni poti sklopljeni. Na tak način delujeta tudi prej omenjena antibiotika, trimetoprim in sulfonamid. Da timinsko stradanje povzroči z mazEF programirano celično smrt je bilo dokazano tudi eksperimentalno. Pri tem so uporabili sev E. coli z izbrisanim zapisom za mazEF in divji tip E. coli. Seva so pustili rasti na gojišču brez timina oz. v prisotnosti prej omenjenih antibiotikov. Rezultati poskusa o bili v skladu s pričakovanji: delež preživetja je bil skoraj 100-odstoten na prvem gojišču, medtem ko je bil delež preživetja na drugem gojišču precej nižji. Poleg tega, naj bi se v času timinskega stradanja, povzročenega s trimetoprimom, drastično zmanjšala tudi transkripcija promotorja P2, ki je odgovoren za regulacijo mazEF, zaradi česar je bil morda delež preživetja divjega tipa ob prisotnosti trimetoprima še nekoliko nižji. Poleg tega so predhodne raziskave pokazale, da timinsko stradanje poveča verjetnost za nastanek poškodb na DNA, med drugim tudi takšnih, ki vključujejo prelome in zasuke kromosomov v konfiguracije, ki se dokaj uspešno upirajo celičnim popravljalnim mehanizmom. Takšne vrste poškodb DNA pa bi lahko bile posledično odgovorne tudi za zmanjšano izražanje promotorja P2, zaradi njegove unikatne strukture. Na takšen način bi torej timinsko stradanje lahko neposredno vplivalo na aktivnost promotorja P2. Na zmanjšano aktivnost ima posreden vpliv tudi že prej omenjena sinteza gvanozin 30,50-bispirofosfata. Izključiti pa ne moremo niti vloge proteinov, ki igrajo vlogo pri zaznavanju poškodb DNA. Da povzamem, ob kontinuirnem izražanju labilnega antitoksina MazE kot posledica timinskega stradanja, nastopi celična smrt. Zaenkrat je znano, da timinsko stradanje vpliva na aktivnost promotorja P2 mazEF, ni pa znano, ali morda vpliva še na katerega izmed ostalih promotorjev. V tem primeru bi lahko imelo vpliv na gene, katerih produkti bi lahko bili prav tako vključeni v z mazEF programirano celično smrt.

Viri

B. C. Mohan Ramisetty, B. Natarajan, R. Sarojini Santhosh, mazEF-mediated programmed cell death in bacteria: ‘‘What is this?’’, Crit Rev Microbiol, Published online, 24 June, 2013

H. Engelberg-Kulka, B. Sat, M. Reches, S. Amitai and R. Hazan, TRENDS in Microbiology, Bacterial programmed cell death systems as targets for antibiotics, Vol.12, No.2, 2004

I. Kolodkin-Gal, B. Sat, A. Keshet, H. Endelberg-Kulka, The Communication Factor EDF and the Toxin-Antitoxin Module mazEF Determine the Mode of Action of Antibiotics, 16 December, 2008, Research article.