Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi

Uvod

Herpesvirusi so velika družina virusov, ki imajo dvojnovijačno DNA. Ostali predstavniki takšnih virusov so adenovirus, poksivirusi, papilomavirus in vacinia virus. Poznamo osem vrst herpesvirusov, ki jih delimo v tri poddružine, in sicer α, β in γ. Herpesvirusi α se nahajajo v živčnih ganglijih gostitelja. Zanje je značilno hitro podvojevanje. Herpesvirusi β povzročajo močno povečanje okužene celice, herpesvirusi γ pa pogosto povezujemo z nastankom raka. V seminarski nalogi se bomo osredotočili na hespesvirus simpleks 1.

Okužbeni cikel

Okužbeni cikel se začne z invazijo celice, ki lahko poteka na dva načina. Prva možnost je, da se virusna ovojnica zlije s celično membrano in ostane njen sestavni del, proteinske komponenete pa v citoplazmo vstopijo ločeno od virusne DNA. Pri zlitju sodelujejo glikoproteini v virusni ovojnici. Zlivanje lahko razdelimo na tri faze. V fazi I se celična membrana in virusna ovojnica približata na tako majhno razdaljo, da se glikoprotein na površini ovojnice veže najprej na proteoglikan heparan sulfat, nato pa še na celični membranski receptor. V fazi II se komponente membrane in ovojnice začnejo mešati, prav tako pa se oblikuje hemifuzijska vmesna pora, ki je predhodno stanje fuzijske pore. V fazi III se dokončno oblikuje stabilna fuzijska pora s sodelovanjem petih vrst glikoproteinov. Prisotnost glikoproteinov poveča učinkovitost zlivanja, saj ti sodelujejo v prvem stiku med ovojnico in membrano. Glikoproteini tudi omogočajo lipidom ovojnice in membrane, da se lahko mešajo. Zatem virus sprosti svojo DNA v citosol skozi fuzijsko poro. Druga možnost je fagocitoza. Glikoproteini se enako kot prej najprej povežejo s proteoglikanom heparan sulfatom na površini filopodijem podobnih struktur, ki jih celica izteza proti virusu in nato z receptorji. Pri tem kot vez med površinskimi receptorji in aktinskimi filamenti, iz katerih so zgrajeni prstasti izrastki, sodelujejo proteini iz družine Rho-GTPaz. Filopodiji, ki se torej povežejo z glikoproteini, objamejo celoten virusni delec.

V jedro potuje virus oz. njegovi sestavni deli v obeh primerih vzdolž mikrotubulov s pomočjo dineinov. Najprej se prenese do mikrotubulnega organizacijskega centra in od tam do jedrnih pornih kompleksov, na katere se veže in DNA vstopi v jedro. Virusna DNA se vgradi v DNA gostiteljske celice, kjer se potem prepisuje in podvojuje.

Struktura virusne ovojnice

Genom v sredini herpesvirusa neposredno obdaja kapsida. To je beljakovinski ikozaedrični ovoj, zgrajen iz 162 ikozamer, po sredini katerih poteka kanalček. Pri virusih herpesa simpleksa k stabilizaciji kapside pripomorejo strukturni elementi, imenovani proteini tripleks. Kapsido gradi več kapsidnih proteinov tipa B, ki katalizirajo proces sestavljanja virusne ovojnice. Okoli kapside je nameščen tegument. O njegovi funkciji ni veliko znanega, vemo pa, da je to beljakovinski plašč iz 5 vrst proteinov. Zunanja lipidna ovojnica izvira iz membrane Golgijevega aparata okužene celice. Vsebuje virusne glikoproteine, ki so oblikovani v bodice in štrlijo iz ovojnice navzven ter vsaj 8 tipov različnih proteinov, ki sodelujejo pri vstopu virusa v celico.

Replikacija

Genom

Genom herpesvirusa je velik, kompleksen in krožen. Sestavljen je iz dveh regij UL in US. Vsebuje tri mesta replikacije, in sicer oriL in oriS, ki se pojavi v dveh kopijah. Obe mesti replikacije vsebujeta z adenozini in timini bogato regijo, v bližini katere je veliko prepoznavnih mest za ori-vezavne proteine. Genom kodira sedem proteinov, ki so esencialni za replikacijo. UL9 kodira za protein, ki veže proteine na mesto ori, poleg tega pa ima tudi helikazno funkcijo. UL30 kodira za katalitično podenoto DNA polimeraze, UL42 pa za procesivno enoto. UL5, UL8 in UL52 kodirajo za protein, ki je podenota helikaznega-primaznega kompleksa (H/P kompleks), vsak pa ima drugačno funkcijo. UL5 vsebuje helikazni, UL52 pa primazni motiv. Funkcija UL8 je ta, da interagira z drugimi proteini. Poleg teh je zelo pomemben še gen UL29 (ICP8), ki kodira za ssDNA-vezavne proteine.

Mehanizem replikacije

Proces replikacije se začne na enem od mest ori, ki vsebuje UL9 in ICP8. UL9 in ICP8 delujeta tako, da popačita z adenini in timini bogato regijo in destabilizirata mesto ori. To se zgodi tako, da se dva UL9 dimera vežeta na škatli I in II ter skupaj z ICP8, v prisotnosti ATP, inducirajo formacijo lasnice. Pri tem pride do konformacijskih sprememb v UL9, kar povzroči, da izgubi afiniteto do vezave na mesto ori. Izpostaljena ssDNA povzroči konformacijske spremembe v ICP8, ki se nato sprosti z UL9 in se veže na ssDNA in prepreči, da bi se veriga ponovno povezala z drugo. Kompleks H/P odvije dvoverižno DNA in sintetizira začetni oligonukleotid, a le v primeru, ko ima na voljo vsaj šest nukleotidov dolgo enoverižno verigo. Za vezavo polimeraze na DNA so potrebne konformacijske spremembe v kompleksu H/P in RNA primerju. Ko se polimeraza pritrdi na replikacijske vilice, se začne sinteza vodilne in zastajajoče verige. Ko se replikacijski vilici srečata, iniciatorski protein prereže eno od verig. Nerezana veriga služi kot matrica za replikacijo rezane verige. Pri tem nastane konkatemerna DNA, ki se nato cepi in zapakira.

Iniciacija transkripcije

Pri virusu Herpes Simpleks tipa 1 (HSV-1) je znotraj linearnega virusnega genoma, ki je dolg 152 kbp, kodiranih približno 80 genov. Geni se izražajo v treh zaporednih fazah in se prepisujejo s pomočjo celične RNA polimeraze II. Vsi virusni promotorji imajo značilno nukleotidno zaporedje imenovano TATA škatla, ki se nahaja 25 nukleotidov navzgor od začetnega mesta transkripcije. Genom HSV-1 je sestavljen iz treh skupin genov: takojšnji zgodnji, zgodnji in pozni geni.

Mehanizem

Prvih pet genov, ki jih je treba pri okužbi prepisati, so takojšnji zgodnji geni, ki se v nukleotidnem zaporedju razlikujejo od zgodnjih in poznih genov. Imajo posebno zaporedje TAATGARA, ki se nahaja navzgor od promotorja. Za začetek izražanja je potreben transkripcijski faktor, ki po vezavi na promotor sproži prepisovanje gena. Vezavno mesto na nukleotidni verigi prepozna protein iz virusnega tegumenta, imenovan protein VP16. Vezava VP16 na molekulo DNA ni možna, če niso prisotni dodatni proteini, ki tvorijo kompleks in na ta način vezavo stabilizirajo ter sprožijo prepisovanje gena. Kompleks tvorijo protein VP16 in dva dodatna proteina gostiteljske celice, HCF in Oct-1. HCF stabilizira vezavo na nukleotidnem zaporedju, dokler Oct-1 ne aktivira RNA polimeraze II. RNA polimeraza II začne prepisovati nukleotidno zaporedje v mRNA. Po sintezi mRNA sledi zorenje mRNA in njen prenos do citosolnih celičnih ribosomov, kjer pride do translacije kodona in sinteze α proteinov. Enako kot pri takojšnjih zgodnjih genih tudi zgodnji in pozni geni potrebujejo virusno kodirani transkripcijski faktor, ki iniciira začetek transkripcije. Ta se imenuje ICP4 in eden od proteinov α. Zapisan je na takojšnjih zgodnjih genih. ICP4 je jedrni fosfoprotein, ki deluje kot homodimer za aktivacijo ali utišanje transkripcije, odvisno od promotorja, na katerega se veže. ICP4 je nujno potreben za izražanje zgodnjih in poznih genov. V odsotnosti transkripcijskega faktorja ICP4 so zgodnji geni slabo izraženi, takojšnji zgodnji geni pa so prekomerno izraženi. Prekomerno izražanje teh genov povzroči, da ICP4 prepreči transkripcijo svojega lastnega promotorja in nekaterih drugih promotorjev na takojšnjih zgodnjih genih. Vezava ICP4 na promotorske regije zgodnjih in poznih genov je bistvena za začetek transkripcije samega gena. ICP4 tvori trimer v območju TATA škatle. V trimeru se poveže s TBP in TFIIB. Ta povezava stabilizira vezavo TAF250 na DNA in tako aktivira RNA polimerazo II, ki začne transkripcijo genov. Sintetizirani mRNA sledi zorenje in prenos do citosolnih ribosomov. V tej skupini genov na ribosomih poteka translacija proteinov β, ki so večinoma dejavniki prepisovanja poznih genov ali encimi (UL9, vezavni DNA protein UL29(ICP8), DNA polimeraza, timidinska kinaza). Naslednja faza je transkripcija poznih genov in sinteza strukturnih proteinov na citoplazemskih ribosomih. Tudi pri tej skupini genov je seveda izražanje nadzorovano. Eden izmed glavnih proteinov, ki aktivira transkripcijo poznih genov, je protein ICP4. Drugi protein je ICP8, ki ima pomembno vlogo pri podvojevanju virusne DNA, v tej skupini genov pa transkripcijo zavira. Mehanizem regulacije izražanja poznih genov ni natančno določen, a znano je, da visoka koncntracija prostega proteina IPC8 močno utiša transkripcijo poznih genov in posledično sintezo strukturnih proteinov γ.

Sestavljanje virusne ovojnice in pakiranje nukleinske kisline vanjo

Nukleinske kisline se pri herpesvirusih spakirajo v že oblikovano kapsido, ki se nato obda s tegumentnimi proteini in glikolipidno ovojnico. Sestavljanje kapside je faza replikacije virusa, ki sledi prepisu poznih genov in sintezi gradnikov ovojnice (predvsem proteinov). Začne se s transportom gradnikov kapside iz citoplazme gostiteljske celice, kjer se sintetizirajo, v jedro, kjer sestavljanje poteka. Trije proteinski sestavni deli kapside so dovolj majhni, da vstopijo skozi jedrne pore, eni (MCP ali glavni kapsidni proteini), ki jim med drugim manjka tudi jedrni lokalizacijski signal, pa so večji in se morajo povezati s pAP (»assembly protein precursor«), ki usmerja v jedro. Tu obstajata dve teoriji transporta MCP v jedro: 1) en MCP se prenese v jedro, povezan z enim pAP in 2) MPC in pAP se povežeta v protokapsomere in se v jedro preneseta v taki obliki. Tam nato poteče povezovanje heterodimerov iz MCP in pAP oz. protokapsomerov s tripleks proteini. Sledi zorenje kapside (proteaze cepijo pre-B-kapsidne proteine v B-kapsidne proteine) in pakiranje DNA vanjo v jedru gostiteljske celice. Pakiranje poteka s pomočjo encima, ki stimulira terminacijo replikacije. Nato zreli virusi skupaj s sestavinami tegumenta izstopijo iz jedra, potujejo proti celični membrani skozi Golgijev aparat, kjer pridobijo ovojnico, nato pa zapustijo celico z eksocitozo.

Širjenje virusov iz celice v celico

Herpesvirusi se namesto uporabe celic imunskega sistema iz okuženih v neokužene celice širijo prek tesnih stikov, sinaps ali pa uporabijo aktinu podobne strukture za direkten prenos iz celice v celico. Lahko tudi povzročijo zlivanje membran okuženih celic z neokuženimi.

Viri in literatura

• Salameh, S. et al. Early events in herpes simplex virus lifecycle with implications for an infection of lifetime. The Open Virology Journal, 2012, 6, str. 1-6
• Gibson, W. Structure and assembly of the virion. Intervirology, 1996, 39, str. 389-400
• Weller, S. K., Coen, D. M. Herpes Simplex Viruses: Mechanisms of DNA Replication. Cold Spring Habor Perspective in Biology, 2012, 4 (9), str. 1-15
• Kim D., Zabierowski S., DeLuca N. A. The initiator element in a herpes simplex virus type 1 late-gene promoter enhances activation by ICP4, resulting in abundant late gene expression. J. Virol. 2002;76:1548–1558
• Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis - PubMed - NCBI. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21348071. Accessed April 13, 2018.