Mehanizmi popravljanja DNA pri arhejah

Uvod

Arheje nemalokrat najdemo v okoljih z ekstremnimi pogoji - visoka temperatura/tlak, visoka vsebnost soli, kisla/bazična okolja ipd. Tovrstni pogoji močno zvišujejo možnost napak v genetskem zapisu, zato je pričakovano, da imajo arheje bolj razvite mehanizme popravljanja napak DNA. Avtorji preglednega članka zajemajo obstoječa znanja o mehanizmih popravljanja DNA pri arhejah.

Splošno o napakah in popravljalnih mehanizmih DNA

Na DNA destruktivno delujejo trije glavni dejavniki: intrinzična (ne)stabilnost DNA, notranji in zunanji dejavniki. Notranji dejavniki so lahko spontano hidroliziranje DNA, deaminacija DNA in torzijska napetost (ang. torsional stress) - napetost, ki je posledica rotacije/zvijanja DNA. Še en tovrstni dejavnik je tvorba kisikovih reaktivnih zvrsti (ang. ROS - reactive oxygen species). Poleg tega morajo celice prenašati tudi zunanje dejavnike destabilizacije DNA: temperatura, zunanji ROS-i, mutagene spojine, UV svetloba in druge vrste sevanj. Veliko arhej pa v tako grobih razmera ne le preživi, ampak celo uspeva. Veliko halofilnih arhej živi v slanih razmerah in veliki količini UV sevanja [1], nekatere hipertermofilne vrste uspevajo pri temperaturah, pri katerih čista DNA denaturira. Kljub tovrstnim razmeram pa imajo arheje genomsko stabilnost, primerljivo z E. coli [2] - genomska stabilnost je definirana kot število oz. pogostost spontanih mutacij DNA. Paradoksalno pa še ni bilo odkritega mehanizma popravljanja DNA, ki bi bil značilen za arheje. Vseeno pa nam vpogled v ohranjanje arhejskega genoma podajajo procesi, ki zaznajo in pretvorijo poškodovano DNA v popravljive "substrate". Popravljanje DNA se deli na tri osnovne korake: 1) Prepoznanje napake v DNA, 2) Začetek popravljanja DNA, 3) Ligacija popravljene DNA. Poznamo različne napake v zapisu DNA, ki zahtevajo različne popravljalne mehanizme: Poprava preloma obeh verig (DSB - double-strand break), popravljanje neujemanja baznih parov (MMR - mismatch repair), popravljanje z odcepom baze (BER - base excision repair) in popravljanje z odcepom nukleotida (NER - nucleotide excision repair). V nadaljevanju bomo obravnavali vsakega od navedenih popravljalnih mehanizmov.

Prelom obeh verig (DSB)

Tovrstne napake so najbolj destruktivne, saj razdvojijo genom, ob katerem sta oba konca DNA verige izpostavljena. DSB-ji so lahko posledica napak pri replikaciji ali transkripciji, pojavijo pa se tudi pri nekaterih metabolnih poteh DNA, kjer se DNA namerno prelomi - problem nastane, ko pride do namernega preloma, a se v tem koraku proces ustavi. Nepopravljeni DSB-ji so izjemno problematični za celično homeostazo. Povzročijo lahko zaustavitev replikacije in transkripcije, kar lahko privede tudi do apoptoze. Za popravo DSB-jev obstajata dva mehanizma, ki med seboj tekmujeta: poti popravljanja DSB nagnjene k napakam (ang. Error-prone) in homologno rekombinacijsko popravljanje DSB (ang. homologous recombination based). Prednost prvega mehanizma je v tem, da je hiter in ne zahteva nepoškodovane regije DNA za popravo. Njegova slabost pa je v tem, da so tovrstni mehanizmi nagnjeni k izgubi genetske informacije. Poznamo dve vrsti error-prone popravljanja: MMEJ (Microhomology-Mediated End Joining) in NHEJ (Non-Homologous End Joining). Prva temelji na povezovanju manjših homolognih sekvenc v bližini DSB. Pri takšnem procesu obstaja možnost izgube genetskega materiala, poleg tega pa so problematični primeri, ko so homologne sekvence močno oddaljene od DSB mesta (to pomeni še več izgube dedne informacije). Druga (NHEJ) pa ne potrebuje homolognih sekvenc, saj se na oba konca DBS mesta veže po en Ku protein. Proteina se s proteinskim kompleksom združita. Na koncu procesa je potrebna še ligaza, ki konca zlepi. Poleg error-prone načina popravljana DSB-jev pa obstaja še homologno rekombinacijsko popravljanje, ki je dosti bolj natančno, pa tudi energetsko bolj drago. Proces zaznamuje predvsem popravljanje DNA na podlagi pomožne (nepoškodovane) verige. Pri tem procesu je vredno omeniti crossover dogodek, ki se imenuje Holliday junction, ki igra vlogo tudi pri samem evolucijskem razvoju arhej.

Popravilo neujemajočih se baznih parov (MMR)

Popravljanje neujemajočih se baznih parov pri nekaterih arhejah poteka po enakem mehanizmu kot pri bakterijah in evkariontih, in sicer po poti MutL/MutS, kar je značilno denimo za metanogene arheje. Pri nekaterih vrstah arhej, ki nimajo homologov za encima MutL in MutS, pa so odkrili, da popravljanje neujemanja baznih parov poteka s pomočjo encima NucS/EndoMS, spet tretje pa še nimajo odkritega mehanizma za popravljanje neujemajočih baznih parov. Pri popravljanju po poti MutL/MutS MutS najprej prepozna neujemanje baznih parov na nastajajoči verigi DNA in se veže na verigo. Ko je vezan na neujemajočo se verigo DNA, MutS veže MutL, kompleks MutS-MutL pa nato aktivira MutH. MutH zareže verigo na nemetiliranih mestih metilacije GATC, kar omogoča razlikovanje med matrično in nastajajočo verigo DNA. Nemetilirana je namreč novo nastajajoča veriga, kjer je verjetno prišlo do napake. Nato naj bi helikaza UvrD izvedla premik poškodovane verige, ki jo nato razgradijo generične celične eksonukleaze. To nato omogoči DNA polimerazi, da ponovno sintetizira nastalo vrzel iz nepoškodovane verige, in DNA ligazi, da zapre zarezo. Na podlagi izvedenih študij je ta pot podobna kot pri evkariontih, ki pa za razliko od arhej ne vsebujejo MutH in UvrD. NucS oziroma EndoMS je bil najprej prepoznan pri arheji vrste Pyrococcus furiosus. Na podlagi strukture DNA:NucS/EndoMS kompleksa sklepajo, da encim neujemajoče se bazne pare prepozna na podlagi mehanizma obračanja baz. NucS/EndoMS nato prereže obe verigi DNA, kar ima za posledico substrat, podoben DSB z dvema 4 nukleotidov dolgima 5' previsoma, pri čemer še ni jasno, kaj se nato s tem substratom zgodi. Aktivnost NucS/EndoMS je modulirana z replisomom, pri čemer je mehanizem podoben kot pri prokariontih, saj pri bakterijah NucS/EndoMS interagira z beta sponko, pri arhejah pa z PCNA, ki ima enako funkcijo kot beta sponka.

Popravilo z izrezom baze (BER)

Kanonična pot BER pri arhejah vključuje prepoznavanje specifičnih baznih modifikacij z glikozilazo, ki ustreza vsaki modifikaciji, pri čemer lahko ena glikozilaza prepozna več vrst modifikacij baz. Arhealna GO glikozilaza iz poddružine Ogg (AGOG) v arheji vrste Thermococcus kodakarensis tako prepoznava modifikacije 8-okso-gvanina (8oxoG), ki so posledica oksidacija gvanina in deluje kot bifunkcionalna glikozilaza, saj poleg tega, da prepozna in izreže modificirano bazo, cepi tudi verigo DNA, tako da nastaneta 5' deoksiribozafosfat (dRP) in 3' nenasičen aldehid (UA). AP endonukleaza nato pretvori 3'nenasičen aldehid v 3'OH. DNA polimeraza B nato proizvede nadomestno verigo. Flap endonukleaza Fen1 potem odstrani poškodovano verigo, na koncu pa DNA ligaza zapre nastal zarez. Poti alternativnega popravljanja z izrezom (AER) so značilne za hipertermofilne arheje in se v nasprotju s klasično BER ne zanašajo na izrez poškodovane baze in kasnejše prepoznavanje mesta AP kot ločenih korakov, kar pospeši popravilo specifičnih vrst poškodb. Endonukleaza V tako veže in odreže verigo DNA dva nukleotida stran od 3' konca deaminirane baze, kar sproži procese popravljanja navzdol, endonukleaza Q (EndoQ) pa cepi ogrodje DNA na deaminiranih bazah, oksidiranih bazah in mestih AP. EndoQ pri tem deluje po mehanizmu obračanja baz, pri čemer baze postavi v žepek, ki meji na aktivno mesto, kar omogoča cepitev verige v primeru nepravilnega združevanja baz, ki je posledica oksidiranih baz, med katere sodita 5-hidroksiuracil in 5-hidroksicitozin.

Popravljanje z izrezom nukleotidov (NER)

Popravljanje z izrezovanjem baz (NER, ang. nucleotide excision repair) pri bakterijah povzročajo encimi UvrA2/B/C/D, ki prepoznajo poškodbe v nukleotidnem zaporedju (UvrA2), potrdijo, da gre za poškodbo (UvrB), zarežejo v verigo (UvrC) in odstranijo del nukleotidnega zaporedja ter s tem omogočijo ponovno sintezo (UvrD). Nekatere arheje vsebujejo in uporabljajo homologe bakterijskih Uvr encimov – pri arhejah iz razreda Halobacterium izbris dela genoma in posledične odstranitve homologov teh encimov vodi v nastanek na ultravijolično (UV) svetlobo občutljivih sevov, kar nakazuje na to, da ni več načina za popravljanje poškodb na DNA, ki jih povzroči UV svetloba. Večina arhej pa vsebuje homologe encimov, ki sodelujejo v NER pri evkariontih. Pri evkariontih je mehanizem NER podoben, vendar kompleksnejši kot pri prokariontih. Poškodbe na genomu najprej zazna protein XPC, ki nato s tvori kompleks s proteinom XPA. Ta omogoča vezavo helikaz XPB in XPD, ki ločita verigi in tako encimoma XPG in XPF omogočita rezanje verige – vsakemu na svoji strani poškodovanega dela. Poškodovano verigo odstrani TFIIH, kar omogoči ponovno sintezo verige. Arheje vsebujejo homologe obeh helikaz XPB/XPD in endonukleaze XPF, vendar je njihov pravi pomen pri NER mehanizmu arhej neznan. Ob odstranitvi prej omenjenih homologov (XPB, XPD in XPF) iz arheje Thermococcus kodakarensis se je rezistenca seva na UV svetloba zmanjšala, vendar v zelo majhni meri, kar bi lahko nakazovalo na to, da imajo homologi evkariotnskih NER encimov vlogo pri arhejski NER, vendar da zanj niso nujno potrebni. Prav tako obstajajo teorije, da v večini arhej NER ni ohranjen, saj do sedaj ni bilo odkritih nobenih homologov evkariontskega encima XPG.

NER se lahko sproži tudi ob prepoznavi transkripcijskih elongacijskih kompleksov (TEC), ki se zataknejo ob poškodbah na DNA, ki vstopajo v aktivno mesto RNA polimeraze, kar imenujemo TC-NER (ang. transcription coupled NER). Protein, ki prepozna in identificira zataknjene TEC-je, se imenuje TRCF (ang. transcription repair coupling factor). Pri evkariontih to nalogo opravlja protein CSB, ki nato omogoči vezavo NER encimov na mesto poškodbe, pri bakterijah pa ima to funkcijo teminacijski dejavnik transkripcije MfD. V arhejah ni znanega homologa teh dveh encimov, kar nakazuje, da se je TC-NER pri arheja razvila evolucijsko neodvisno. Sam obstoj tega mehanizma ni (še) potrjen, vendar znanstveniki domnevajo, da obstaja. Eden izmed razlogov za to je, da so ob proučevanju transkripcije pri arhejah opazili, da na mestih s znanimi poškodbami DNA arhejska RNA polimeraza zastane. Prav tako je bil nedavno odkrit protein Eta, ki je prvi encim v arhejah, za katerega je znano, da povzroča terminacijo transkripcije in ki si deli še nekatere lastnosti s bakterijskim proteinom MfD. Ob odstranitvi encima EtA nastane sev, ki izkazuje slabšo odpornost na UV svetlobo. Pri vseh arhejah, pri katerih je bil odkrit encim Eta, so bili odkriti tudi homologi evkariontskih NER encimov, kar bi lahko nakazovalo, da Eta deluje podobno kot protein CSB, vendar to ne pojasni majhnega vpliva odstranitve homologov evkariontskih NER encimov na rezistenco na UV svetlobo.

Zaključek

Pri arhejah še ni bilo odkritih nobenih unikatnih mehanizmov popravljanja DNA - bodisi so ti podobni evkariontskim ali bakterijskim mehanizmom, pri nekaterih vrstah arhej pa ni še znano, ali gre za podobnost enemu ali drugemu. Skupna lastnost vseh mehanizmov popravljanja DNA pri arhejah je razlika med posameznimi vrstami arhej. Pri enakih načinih popravljanja DNA gre pri različnih vrstah arhej za podobnost ali prokariontom ali evkariontom in ni enovitega pravila za določanje le-te. Le pri TC-NER trenutno razumevanje kaže na evolucijsko samostojno razvit mehanizem, ki pa ni še dokončno proučen in tako tega zaenkrat še ne moremo trditi. Na področju mehanizmov popravljanja DNA pri arhejah je tako še veliko neznanega in veliko potenciala za nadaljne raziskave.

Viri

[1] Gehring, A. M., & Santangelo, T. J. (2017). Archaeal RNA polymerase arrests transcription at DNA lesions. Transcription, 8(5), 288–296. https://doi.org/10.1080/21541264.2017.1324941

[2]Jones, D. L., & Baxter, B. K. (2017). DNA repair and photoprotection: Mechanisms of overcoming environmental ultraviolet radiation exposure in halophilic archaea. In Frontiers in Microbiology (Vol. 8, Issue SEP). Frontiers Media S.A. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.01882

[3]Marshall, C. J., & Santangelo, T. J. (2020). Archaeal DNA repair mechanisms. In Biomolecules (Vol. 10, Issue 11, pp. 1–23). MDPI AG. https://doi.org/10.3390/biom10111472

[4]Grogan D.W., Carver G.T, Drake J.W. Genetic fidelity under harsh conditions: Analysis of spontaneous mutation in the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001;98:7928-7933