Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga
Geni za odpornost na antibiotike (Abr)
Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ta zaporedja vodijo ribosome, da se le-ti vežejo na mRNA in se pravilno poravnajo za pričetek translacije. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr).
Začetki zastajajoče verige
Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoL.
ssoA
Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.
ssoU
To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.
Iniciatorski in terminalni proteini
Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.
Delovanje Rep proteinov
Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.
Relaksazna funkcija MobM
MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen). Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu.
REPRESORJI
V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.
Protismerna RNA II
Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija). copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta. RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep). Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho.¬ copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.
Transkripcijski represorski protein CopG
Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno. Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°. CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige. Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.
GOSTITELJEVE FUNKCIJE
PcrA helikaza
Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja. Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori). Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata). Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.
DNA giraza
Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje. Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.
ZAKLJUČEK
RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami, ob enem pa jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.
