Širjenje odpornosti proti antibiotikom med talnimi bakterijami
Uvod
Plazmidi, zunajkromosomske (običajno) krožne molekule DNA, spadajo poleg transpozonov, fagov in integronov med mobilne genetske elemente (MGE). To pomeni, da med bakterijami omogočajo prenos genov z različnimi funkcijami, ki jim koristijo pri preživetju in prilagajanju na vedno spreminjajoče se okolje, kot so detoksifikacija težkih kovin, fiksacija dušika in odpornost proti antibiotikom. Slednja predstavlja resno okoljsko težavo, saj so antibiotiki v današnjem svetu izjemnega pomena - inhibirajo razmnoževanje mikroorganizmov in zdravijo bakterijske okužbe. Prekomerna raba antibiotikov vodi v razvoj proti antibiotikom odpornih genov (ARG), ki so dandanes zelo razširjeni v okolju. Plazmidi so glavni vektorji za prenos ARG med bakterijami, in sicer po mehanizmu horizontalnega prenosa genov (HGT) - s transformacijo, konjugacijo ali transdukcijo. Ker igra prst pomembno vlogo pri delovanju biosfere, je raziskovanje prenosa ARG v prsti preko plazmidov izjemnega pomena za ohranjanje javnega zdravja.
Izolacija plazmidne DNA iz okoljskih vzorcev
Metagenomske analize
Za izolacijo in karakterizacijo plazmidov se tradicionalno uporabljajo predvsem metode, ki temeljijo na gojenju mikrobnih kultur. Pri vzorcih, pridobljenih iz okolja (na primer prsti ali morskih ekosistemov), pa je zaradi kompleksnosti mikrobnih združb to pogosto preveč zahtevno; ocenjeno je, da je le približno 1 % mikroorganizmov primeren za gojenje v gojišču. V zadnjih letih se je razvil nov pristop, metagenomika, ki temelji na sekvenciranju in analizi mešanice vseh mikrobnih genomov (metagenomov), prisotnih v vzorcu iz okolja. Ponuja nam vpogled v zgradbo mikrobnih skupnosti in nam pomaga identificirati posebne genetske elemente. Težava nastopi pri plazmidni DNA, saj predstavlja le majhen delež celotne DNA in je verjetnost kontaminacije s kromosomsko DNA zelo visoka. Za izolacijo plazmidov iz okoljskih vzorcev se je razvilo več različnih postopkov in dva najbolj obetavna sta opisana v nadaljevanju. Obema je skupen prvi korak po ekstrakciji metagenomske DNA: odstranitev genomske (kromosomske) DNA.
Odstranitev genomske DNA
Za izolacijo plazmidne DNA se metagenomsko DNA izpostavi od ATP-odvisni DNazi, PSD (plasmid-safe DNase). Ta encim razgradi zgolj genomsko DNA, krožno plazmidno DNA pa ohrani intaktno. Kasneje se lahko prisotnost genomske DNA sproti preverja s PCR analizo 16S rRNA gena; ker ni znano, da bi bil le-ta prisoten pri plazmidih, je pri analizi uporabljen kot indikator genomske DNA.
TRACA
TRACA (transposon aided capture method) je metoda, ki omogoča izolacijo plazmidov iz metagenomskih DNA ekstraktov in njihovo kasnejše vzdrževanje v gostiteljskih vrstah, na primer E. coli. Njena prednost je, da lahko z njo uspešno izoliramo tudi plazmide, ki ne vsebujejo konvencionalnih selekcijskih markerjev. Po odstranitvi genomske DNA sledi in vitro insercija transpozonov z elementom EZ-Tn5, ki vsebuje selekcijski marker in mesto ori za E. coli. Plazmide se nato s transformacijo vstavi v nadomestne gostitelje, bakterije E. coli. Sledi izolacija plazmidov in sekvenciranje. Seveda ima tudi ta metoda svoje omejitve, na primer ne moremo identificirati prvotne gostiteljske vrste, prav tako lahko transpozoni inaktivirajo iskane gene.
MDA
Metoda MDA (multiplex displacement amplification) temelji na amplifikaciji očiščene plazmidne DNA, saj so pri sekvenciranju potrebne dokaj velike količine iskane DNA. Plazmidno DNA se selektivno amplificira s phi29 polimerazo. Rezultat je zbirka konkatemer, velikih molekul DNA, ki vsebujejo več zaporednih kopij plazmidne DNA. Sledi sekvenciranje DNA, na primer Illumina sekvenciranje.
Mehanizem prenosa ARG s plazmidi
Pri širjenju ARG preko plazmidov je problematična predvsem njihova sposobnost, da hitro pridobijo tuje gene in jih lahko prenesejo na širok spekter gostiteljev, tudi v druge mikrobne skupnosti. Plazmidi, ki sodelujejo pri širjenju ARG, imajo pomožne regije, sestavljene iz enega ali več genov z odpornostjo na antibiotike ter mobilnih elementov. Mobilni genetski elementi se lahko premikajo v ali med posameznimi DNA molekulami, to so insercijske sekvence (IS), prestavljivi (transposable) genetski elementi (Tn) in genske kasete (In). Mobilni genetski elementi, ki se premikajo med bakterijskimi celicami pa so plazmidi sami. Horizontalni prenos genov poteka v treh korakih. Začne se z iniciacijo, tej sledi transfer genskega materiala v celio in konča se z integracijo pridobljenega genskega materiala v genotip receptorske celice. Med plazmidi je najbolj pogost način prenosa genov z odpornostjo na antibiotike s konjugacijo. Pri konjugaciji se genski material med bakterijami prenese preko fizičnega stika med celicami. Prenos se začne na mestu začetka prenosa DNA, oriT na plazmidu. Proteini TraI, TraM in TraY sestavljajo relaksosom, ki se skupaj z IHF (integration host factor) veže na oriT. Pri tej vezavi sodelujejo še pomožni proteini in encim relaksaza. Sklopitveni protein tipa IV pa povezuje relaksosom s paritvenim kompleksom, ki tvori paritveni kanal med receptorsko in prejemniško celico. Encim relaksaza na mestu nic v oriT zareže DNA, plazmid spremeni konformacijo iz zvite v krožno sproščeno. Relaksaza skupaj s sklopitvenim proteinom vodi verigo T skozi paritveni kanal v prejemniško celico. Ko se T-verga DNA prenese v prejemniško celico, se enoverižna DNA pretvori v dvoverižno, prenešeni geni se tako lahko začnejo izražati v prejemniški celici.
Prenos in širjenje ARG v okolju
Prisotnost ARG v okolju
ARG najdemo v številnih okoljih, tako močno onesnaženih z antibiotiki kot popolnoma neokrnjenih, na primer v polarnih regijah in na morskem dnu. V študiji vzorcev arktičnega permafrosta je bilo odkritih 70 ARG, povezanih z 18 antibiotiki. Ugotovljeno je bilo, da genomi mikroorganizmov iz permafrosta vsebujejo podobne mobilne elemente, kot jih imajo klinični bakterijski sevi, kar nakazuje na visoko stopnjo horizontalnega prenosa genov.
Antropogeni vplivi na širjenje ARG
Prekomerna raba antibiotikov v zdravstvu in živinoreji vodi do zastajanja ostankov antibiotikov v kliničnih okoljih, prsti kmetijsko obdelanih površin, čistilnih napravah in drugod. To predstavlja velik problem, saj so ostanki antibiotikov lahko strupeni za organizme, hkrati pa prispevajo k širjenju ARG. Najpogosteje ljudem predpisani antibiotiki - betalaktami, kinoloni in metotreksat - se velikokrat znajdejo v odpadnih vodah bolnišnic in predvsem gospodinjskih odpadnih vodah, kar močno obremeni lokalne čistilne naprave; te lahko postanejo žarišče bakterijskega horizontalnega prenosa genov in proti antibiotikom odpornih bakterij (ARB), ki imajo pogosto več različnih ARG. Raziskava vzorcev blata iz čistilnih naprav je pokazala prisotnost velikega števila MGE, tudi plazmidov. V bolnišnicah so sicer z odstranjevanjem antibiotikov iz odpadnih vod precej uspešni (74-81%), se pa ta delež razlikuje med posameznimi tipi antibiotikov; učinkovitost odstranjevanja betalaktamskih antibiotikov je tako precej večja kot pri ofloksacinu. Tudi v kmetijstvu so ARG vse bolj prisotni. Uporaba amoksicilina na farmah s perutnino je povzročila kontaminacijo okolja (prsti, odpadnih vod, krme) z blaNDM in širjenje bakterij, ki nosijo zapis za ta ARG. Študija mcr-1-pozitivnih sevov E. coli iz perutnine je dokazala, da so le-ti odporni proti večim zdravilom; več kot 88,24% izolatov je vsebovalo gene blaTEM ter gene, odporne proti tetraciklinu (tetA in tetB) ter sulfonamidu (sulI, sulII, sulIII). H kontaminaciji okolja z ARG močno prispeva tudi uporaba organskih gnojil.
Vpliv drugih dejavnikov na širjenje ARG
Na prenos in širjenje ARG preko plazmidov v okolju vplivajo različni dejavniki, tudi taki, ki so posledica okoljskih onesnaževalcev, na primer težkih kovin in kemikalij, ter celo mikroplastika tako v vodnih kot zemeljskih okoljih. Zato je pomembno razumevanje, kako in v kakšni meri ti okoljski dejavniki vplivajo na širjenje odpornosti na antibiotike preko plazmidov. Raziskave ARG in težkih kovin so pokazale, da igrajo slednje pomembno vlogo pri povečanju integracije ARG pri bakterijah v prsti kmetijskih površin. Nanodelci bakrovega oksida in bakrovi ioni lahko olajšajo konjugativni prenos ARG; podoben vpliv imajo kadmijevi ioni ter visoke koncentracije nanodelcev Fe₂O₃. Visoke koncentracije kovin v prsti vplivajo na sestavo bakterijskih skupnosti. Tudi minerali v prsti in herbicidi vplivajo na hitrost konjugativnega prenosa ARG.
Zaključek
...
Viri
...
