Metilacijski vzorci na DNA: nastanek, dedovanje in pomen

Uvod

Metilacije DNA so pomemben mehanizem dinamičnosti kromatina in uravnavanja transkripcije. Poleg razumevanja, kaj se dogaja na molekulski ravni, kako se te spremembe dedujejo in kako vplivajo na delovanje organizmov, je pomembno tudi zavedanje, da lahko napake v metilaciji (prekomerna metilacija ali izostanek le-te) vodijo do različnih kliničnih stanj.

NASTANEK

Metilacije večinoma potekajo na citozinu (C), za katerim stoji gvanin (G). Taka mesta se imenujejo CpG, kar pomeni, da je pred G fosfatna skupina (torej je C bližje 5' koncu). Tak zapis tudi označuje, da sta oba nukleotida eden zraven drugega v isti vijačnici (ne mešajmo s parom CG, ki povezuje obe vijačnici DNA). Včasih pa metilacija lahko poteče tudi na adeninu (A). Najpogosteje se metilna skupina doda na mesto 5 na C (označimo 5mC). Lahko se doda tudi na mesto 4 na C (4mC) ali 6 na A (6mA). Najbolj je raziskan mehanizem nastanka 5mC. Kot omenjeno, se metilacija izvrši hitreje, če citozinu sledi gvanin. CpG otočki, kakor se imenjujejo regije DNA, dolge okoli 1000 baznih parov z veliko gostoto CpG zaporedij, bi morali biti močno metilirani, vendar ni tako. Predpostavi se lahko njihova funkcionalna nepogrešljivost. Vsebujejo manj nukleosomov (DNA, trdno ovita okoli histona, ki oteži prepisovanje), nudijo vezavno mesto transkripcijskim faktorjev in čeprav nimajo promotorskih regij, promovirajo transkripcijo. Ker metilacija ponavadi povzroči utišanje genov, bi si bili funkciji kontradiktorni. Ni še jasno, zakaj in kako te regije ostajajo nemetilirane. Hipermetilacija teh regij lahko privede do raka, saj lahko pride do utišanja tumorsupresorskih genov in genov, ki sodelujejo pri celičnem ciklu in proliferaciji.

ENCIMI

Metilacija je encimsko katalizirana reakcija. Poznamo tri tipe encimov, ki sodelujejo bodisi pri metilaciji bodisi pri demetilaciji.

Writers (pisci)

Sem spadajo encimi iz družine DNA metiltransferaz (Dnmts). Ti katalizirajo reakcijo prenosa metilne skupine iz S-adenil metionina (SAM) na citozinski ostanek (nastane 5mC). Najpomembnejši so Dnmt1, ter Dnmt3a in Dnmt3b. Čeprav so si encimi strukturno podobni (imajo veliko N-terminalno regulatorno domeno in C-terminalno katalitično domeno), imajo različne funkcije in vzorce izražanja. Dnmt1 metilira hemimetilirano DNA (metilna skupina je samo na eni vijačnici); metilno skupino doda na komplementarno verigo diagonalno od že obstoječega 5mC. Deluje med prepisovanjem DNA in skrbi za prepis metilacijskega vzorca iz materinske na hčerinsko celico. Dnmt3a in Dnmt3b lahko metilirata t.i. golo DNA (brez 5mC). Med seboj se razlikujeta v izražanju (a se izraža v vseh tkivih, b pa se nahaja predvsem v ščitnici, modih in kostnem mozgu). Kako poiščeta mesta metilacije, za zdaj še ni znano. Ena izmed teorij predlaga, da de novo metilacijo regulirajo transkripcijski faktorji, ki lahko Dnmts ali rekrutirajo na promotorje ali pa Dnmts metilirajo vsa CpG mesta, na katerih transkripcijskih faktorjev ni, torej s svojo vezavo na promotor preprečujejo metilacijo DNA. Obstaja še četrti član Dnmts, in sicer Dnmt3L, ki pa nima katalitične domene, kot jo imajo ostali trije, ampak se povezuje z Dnmt3a in Dnmt 3b in stimulira njuno metiltransferazno aktivnost. Izraža se v možganih med razvojem zarodka, postnatalno pa ni več prisoten. Dnmt3L je potreben za starševsko genomsko vtisnjenje (tako materino kot očetovo), metilacijo transpozonov in za zgoščevanje X kromosoma.

Erasers (brisalci)

Sodelujejo pri demetilaciji. Ta je lahko pasivna (sledi vsaki celični delitvi, ko se celotna raven metilacije zniža zaradi inhibicije Dnmt1) ali aktivna (lahko poteka v delečih in ne delečih se celicah), ki je encimsko vodena in poteka v več zaporednih reakcijah (deaminacije in oksidacije). Aminska skupina 5mC se lahko deaminira do karboksilne skupine z AID/APOBEC kompleksom (activation-induced cytidine deaminase/apolipoprotein B mRNA-editing enzyme complex); tako nastane timin. Tet encimi (ten-eleven translocation) na metilno skupino dodajo hidroksilno skupino (nastane 5hmC). 5hmC lahko Tet oksidirajo do 5-karboksi-citozina ali pa jih AID/APOBEC deaminirajo do 5-hidroksimetil-uracila. Mehanizem za popravljanje baz z izrezovanjem (base excision repair pathway) nato s pomočjo encima timin DNA glikozilaza (TDG) te produkte zamenja s citozinom. Ta encim je ključen za demetilacijo in je potreben za normalen razvoj osebka. Aktiven TDG naj bi tudi ščitil vtisnjene gene pred spontano de novo metilacijo.

Metilacija ima vlogo tudi pri nastanku prepisno zavrtega heterokromatina. Geni, kjer so promotorji metilirani, so namreč utišani. Približno 70% CpG ponovitev je metiliranih. Znanstveniki predvidevajo, da so metilacije pripomogle k zmanjšanju števila CpG dinukleotidov, saj lahko popravljalni mehanizmi namesto T popravijo G (nastane TA par).

Readers (bralci)

Bralci vplivajo na izražanje genov. Vežejo se na 5mC in preprečujejo vezavo transkripcijskih faktorjev. Metilacijska mesta prepoznavajo MBD proteini (najbolj poznan MeCP2), ki vsebujejo metil-CpG vezavno domeno, večina pa še domeno za represijo transkripcije (TRD), s katero se vežejo v represorski kompleks in tako preprečujejo transkripcijo. MeCP2 ima tudi vlogo pri vzdrževanju metilacije DNA, saj se lahko s TRD domeno veže na Dnmt1 in ga rekrutira na hemimetilirano DNA.

DNA metilacija je povezana s posttranslacijsko modifikacijo histonov. Dnmts reagirajo z encimi, ki regulirajo modifikacijo histonov pri represiji izražanja genov; vežejo se na histonske deacetilaze in pomagajo DNA tesno naviti na histone. Prav tako modifikacije histonov vplivajo na metilacijske vzorce na DNA.

Diferenciacija možganskih celic

Iz multipotentnih celic z nevrogenezo nastajajo nevroni in z astrogliozo astrocite. Razlike v razvoju se pojavijo zaradi različnih ravni metilacije in demetilacije Gfap promotorske regije (Gfap = glial fibrillary acidic protein, enota citoskeleta astrocit, ki zagotavlja obliko in zmožnost premikanja ob porabi energije). Zgodaj v nevrogenezi se Gfap metilira, z demetilacijo se sproži diferenciacija v astrocite. Kasneje se remetilira. Stopnja pomembnosti metilacijskih vzorcev je posebej očitna ob umetnem utišanju gena za Dnmt1. Dnmt1 knockout miši imajo razvijajoče nevrone hipometilizirane, kar pospeši astrogliozo. Zreli nevroni takih miši imajo posledično zelo slabo vzdražnost in njihovi dendriti so slabo razvejani.

Metilacija v že diferenciranih možganih

Glede na prisotnost Dnmt1 v odraslih živčnih celicah, ki se ne delijo več, je tam smiselno predpostaviti neko dodatno vlogo Dnmt. Za raziskavo te se uporablja inhibicija z različnimi inhibitornimi substancami. Če je zapis za določeno substanco vstavljen v genom, mora promotor ta zapis izraziti šele po dokončni diferenciaciji nevronov(saj je za diferenciacijo, kot že omenjeno, Dnmt1 esencialen, živčna celica se brez njega ne razvije). Primer takšnega postmitotičnega promotorja specifičnega za možgane je CamKIIα. Ugotovljeno je bilo, da se metilacija in demetilacija DNA nevrona spreminjata skladno z aktivnostjo nevrona. Depolarizacija nevrona demetilira Bdnf promotor (neurotrofični faktor v možganih). Demetilacija sprosti MeCP2 represorski kompleks, kar poveča ekspresijjo Bdnf. Nevronska aktivnost dodatno povzroči fosforilacijo MeCP2. Fosforiliran MeCP2 se sprosti iz promotorjev, kar omogoči njihovo demetilacijo (uravnavanje vezave MeCP2 na dveh nivojih). Fosforilacija je kratkotrajna posttranslacijska modifikacija. Inhibicija fosforilacije vpliva na slabšo formacijo sinaps, manjšo sinptično plastičnost in tudi na učenje ter spomin.

Metilacijski vzorci DNA, ki se ustvarijo med razvojem, se lahko modulirajo z nevronsko aktivnostjo, da bi lahko izvajali proces učenja in pomnjenja. Ko so mehanizmi, ki ustvarijo in prepoznajo te vzorce, okvarjeni, nastanejo težave pri izvajanju kognitivnih veščin.

Vloga DNA metilacije pri nevroloških in duševnih motnjah

Metilacijski vzorci DNA, ki se ustvarijo med razvojem, se lahko modulirajo z nevronsko aktivnostjo, da bi lahko izvajali proces učenja in pomnjenja. Ko so mehanizmi, ki ustvarijo in prepoznajo te vzorce, okvarjeni, nastanejo težave pri izvajanju kognitivnih veščin.

MeCP2 in Rettov sindrom

Eden od najpogostejših oblik duševne zaostalosti je Rettov sindrom, ki nastane zaradi mutacije metil CpG vezavnega proteina MeCP2. Čeprav se ta protein izraža v večini celic, je še posebej pomemben za normalno funkcijo živčevja. Pri miših izguba MeCP2 v nevronih vodi do nastanka Rettovega sindroma oz. povzroči večino simptomov te bolezni. Fenotip MeCP2-mutirane miši se lahko povrne v prejšnje stanje z obnovitvijo tega gena v postmitotskih nevronih. MeCP2 je reguliran z nevronsko aktivnostjo in uravnava izražaje BDNF (Brain-derived neurotrophic factor). Prekomerno delovanje tega proteina v postmitotskih nevronih MeCP2-mutirane miši izboljša njihov fenotip, kar pomeni, a je MeCP2 pomemben za regulacijo genov, kot je BDNF, ti so pa regulirani z nevronsko aktivnostjo in so esencialni za normalne kognitivne veščine.

Sindromi v povezavi s FMR1

Nepravilna metilacija enega samega gena ali alela ima lahko znatne posledice v možganih. Sindrom krhkega X kromosoma (Fragile X Syndrome, FXS) nastane zaradi metilacije abnormalne ekspanzije CGG ponovitve (200 – 1000-krat, kar naredi to območje gena nestabilno) na FMR1 genu, ki se nahaja na X kromosomu in je pogosta oblika duševne zaostalosti. Hipermetilacija v tem primeru vpliva na utišanje transkripcije. Translacija FMR1 je regulirana z nevronsko aktivnostjo in njen proteinski produkt (FMRP) ima vlogo v sintezi proteinov v sinapsah. Na podoben način nastaneta tudi Prader-Willi-jev in Angelmanov sindrom.

Vpliv drog

Metilacija DNA se lahko spremeni tudi s ponavljajočo modulacijo mikrookolja možganov, npr. z električno stimulacijo. Po enakem principu delujejo tudi droge – uživanje kokaina zviša izražanje MeCP2. Ena od posledic so tudi postranslacijske modifikacije komponent, ki sodelujejo pri metilacijah.

Psihološki dejavniki

Spremenjeni metilacijski vzorci DNA so povezani z mnogimi psihološkimi motnjami, npr. s stresom v rani mladosti. Materino zanemarjanje je bil dovolj velik razlog za spremembo v stopnji metilacije DNA pri glodalcih. Povišala se je metilacija znotraj promotorja glukokortikoidnih receptorjev in s tem se je reduciralo njihovo izražanje. Ta vzorec se je ohranil še v odrasli dobi, kar je vodilo v večji odziv na stres. Enako se odzivajo tudi ljudje, ki so bili izpostavljeni nasilju v otroštvu.

Bipolarna motnja

Je bolezen, ki jo spremljajo epizode hude depresije in neobvladljive manije. Farmakološke študije kažejo na morebitno vlogo DNA metilacije na patofiziologijo te bolezni. Natrijev valproat je zdravilo, ki deluje kot inhibitor histon deacetilaze. Acetilacija histonov je povezana z metilacijo DNA in igra vlogo v epigenetski regulaciji ter izražanju genov.

Poleg tega je S-adenozil metionin (SAM) znan kot učinkovito sredstvo v boju proti tej bolezni. SAM oskrbuje metilna mesta na DNA in okrepi metilacijo le-te in vitro.

Zaključek

Metilacije (predvsem citozina) DNA spadajo med epigenetske spremembe. Diferencirane celice razvijejo stabilne in edinstvene metilacijske vzorce, ki v povezavi s transkripcijskimi faktorji in represorji regulirajo izražanje genov. Metilacije sodelujejo pri utišanju retrovirusnih elementov, regulaciji tkivno specifičnega izražanja genov, genomskem vtisnjenju in inaktivaciji X kromosoma. Natančna regulacija metilacije DNA poteka skozi vse življenje, je esencialna za normalen kognitivni razvoj zarodka, zato že manjše napake v tem mehanizmu vodijo v nevropsihološke motnje.

Viri

• Moore, L. D., Le, T., and Fan, G. (2012). DNA Methylation and Its Basic Function. Neuropsychopharmacology.
• Phillips, T. (2008). The Role of Methylation in Gene Expression. Nature Education 1, 1-5.
• Rountree, M. R., Bachman, K. E., Herman, J. G., and Baylin, S. B. (2001). DNA methylation, chromatin inheritance, and cancer. Oncogene 20, 3156-3165.
• Grayson, D. R., and Guidotti, A. (2013). The dynamics of DNA methylation in schizophrenia and related psychiatric disorders. Neuropsychopharmacology : official publication of the American College of Neuropsychopharmacology 38, 138-66.
• Kuratomi, G., Iwamoto, K., Bundo, M., Kusumi, I., Kato, N., Iwata, N., Ozaki, N., and Kato, T. (2008). Aberrant DNA methylation associated with bipolar disorder identified from discordant monozygotic twins. Molecular psychiatry 13, 429-441.