BCoated

Uvod

Projekt BCoated, ki ga je razvila ekipa Wageningen University & Research v okviru tekmovanja iGEM 2025, predstavlja interdisciplinaren pristop k razvoju trajnostnih in modularnih prevlek za semena na osnovi bakterijske celuloze. Projekt združuje principe sintetične biologije, mikrobiologije, materialnih znanosti in bioprocesnega inženirstva z namenom razvoja okolju prijazne alternative obstoječim prevlekam za semena, ki pogosto vsebujejo sintetične polimere in prispevajo k mikroplastičnemu onesnaževanju. Raziskovalci so želeli razviti popolnoma biorazgradljiv sistem, ki bi ga bilo mogoče prilagoditi različnim kmetijskim potrebam ter vanj vključiti funkcionalne proteine, pesticide ali regulatorne molekule za zaščito rastlin pred abiotskimi in biotskimi stresnimi dejavniki.

Opis projekta

Projekt izhaja iz problema vse večjih pritiskov na globalno kmetijstvo. Kmetijstvo zagotavlja približno 90 % vseh prehranskih kalorij za človeško populacijo, vendar se pridelki vse pogosteje soočajo s kombinacijo abiotskih in biotskih stresnih dejavnikov. Med abiotske stresorje sodijo suša, slanost tal in visoke temperature, med biotske pa glivični patogeni, insekti in parazitske rastline. Posebej občutljivo obdobje je faza kalitve semen, saj lahko že zgodnje poškodbe ali zaviranje kalitve pomembno zmanjšajo pridelek. Obstoječe prevleke za semena sicer omogočajo dostavo pesticidov, herbicidov ali drugih aktivnih spojin neposredno v mikrookolje semena, vendar imajo številne omejitve. Večina trenutnih sistemov temelji na sintetičnih polimerih, ki se slabo razgrajujejo in prispevajo k onesnaževanju z mikroplastiko. Poleg tega komercialne prevleke pogosto niso modularne in jih je težko prilagoditi specifičnim agronomskim potrebam. Evropska zakonodaja REACH bo v prihodnjih letih dodatno omejila uporabo mikroplastike v kmetijskih proizvodih, kar povečuje potrebo po novih materialih za prevleke semen.

Kot rešitev so raziskovalci izbrali bakterijsko celulozo (BC), ki jo producirajo bakterije rodov Gluconacetobacter in Komagataeibacter. Bakterijska celuloza je mreža linearnih β-1,4 povezanih D-glukopiranoznih enot in ima v primerjavi z rastlinsko celulozo številne prednosti. Je zelo čista, saj ne vsebuje lignina, hemiceluloze ali pektina, hkrati pa ima visoko mehansko trdnost, poroznost in sposobnost zadrževanja vode. Zaradi številnih hidroksilnih skupin jo je mogoče enostavno funkcionalizirati z dodatnimi molekulami ali proteini. Projekt BCoated je želel izkoristiti prav to prilagodljivost materiala ter z uporabo sintetične biologije ustvariti platformo za razvoj prilagodljivih prevlek z različnimi funkcionalnostmi. Namesto klasične kemijske modifikacije so se raziskovalci osredotočili na encimske in biološke metode funkcionalizacije, saj so želeli ohraniti trajnostni značaj sistema.

Celoten projekt je bil razdeljen na tri glavne sklope: funkcionalizacijo bakterijske celuloze, razvoj produkcijske platforme in uporabo BC kot prevleke za semena. V sklopu funkcionalizacije so raziskovalci razvijali metode za spreminjanje lastnosti BC, kot so poroznost, sposobnost zadrževanja vode in biorazgradljivost. Pomemben del tega sklopa je bila tudi izdelava zbirke bioloških gradnikov oziroma »part collection«, ki vključuje proteine z domenami za vezavo celuloze (CBD). Te domene omogočajo stabilno sidranje proteinov na BC matriks in s tem ustvarjanje funkcionalnih biomaterialov. Proteini so bili producirani v kvasovki Saccharomyces cerevisiae, ki je bila zasnovana tako, da proteine izloča neposredno v gojišče. Tako se proteini med samo biosintezo BC vgradijo v nastajajoči material.

V okviru produkcijske platforme je ekipa razvila ko-kulturni sistem med bakterijo Komagataeibacter sucrofermentans in S. cerevisiae. Cilj konzorcija je bil povečati donos bakterijske celuloze in hkrati omogočiti njeno funkcionalizacijo. Sistem temelji na metabolnem sodelovanju med obema organizmoma. K. sucrofermentans proizvaja BC iz glukoze, pri čemer nastaja acetat kot stranski produkt. Acetat lahko pri višjih koncentracijah zavira rast bakterije, zato so raziskovalci uporabili inženirano kvasovko, ki acetat porablja in s tem preprečuje zakisanje gojišča. Po drugi strani pa kvasovka proizvaja etanol, ki ga bakterija uporabi v elektronski transportni verigi za dodatno produkcijo ATP, kar poveča proizvodnjo BC. Ker je bila za delovanje sistema ključna ustrezna koncentracija etanola, so raziskovalci razvili tudi sintetično homeostazno vezje za njegovo regulacijo. Če koncentracija etanola postane previsoka, začne zavirati rast bakterije K. sucrofermentans in zmanjševati donos BC. Zato so v kvasovki zasnovali negativno povratno zanko, ki temelji na etanolno inducibilnem promotorju. Ko koncentracija etanola preseže določen prag, promotor sproži izražanje proteaze pTEV+, ki razgradi ključni encim glikolize PGK1. Posledično se zmanjša fermentativna aktivnost kvasovke in produkcija etanola upade. Ko koncentracija etanola ponovno pade, se sistem deaktivira in fermentacija se nadaljuje. Takšna regulacija omogoča stabilnejše delovanje mikrobnega konzorcija in optimizacijo proizvodnje BC. Poleg eksperimentalnega dela so raziskovalci razvili tudi matematične modele za simulacijo dinamike konzorcija in delovanja homeostaznega vezja.

Velik tehnični izziv projekta je predstavljala tudi genetska manipulacija bakterije K. sucrofermentans, saj je ta organizem znan po težavni transformaciji. Ekipa je zato razvila uspešen protokol za transformacijo bakterije in vanjo vstavila heterologne gene za modulacijo lastnosti BC. Med njimi sta gena bslA iz Bacillus subtilis in sintetični gen crdS. Gen bslA vpliva na površinsko morfologijo bakterijske celuloze ter poveča njeno mehansko stabilnost, medtem ko crdS spodbuja nastanek kurdulan-celuloznega nanokompozita in zmanjšuje kristaliničnost BC. Poleg tega so raziskovalci testirali inducibilni sistem hpdR/PhpdH, ki omogoča regulacijo izražanja genov z uporabo levulinske kisline kot induktorja. Glavni del projekta je bila tudi aplikacija BC kot dejanske prevleke za semena. Raziskovalci so uporabili pristop in situ prevleke, pri katerem bakterije neposredno na površini semena proizvajajo bakterijsko celulozo. Kot modelni pridelek so izbrali Sorghum bicolor, ki je pomembna kulturna rastlina v sušnih območjih in je občutljiva na številne škodljivce. Semena so najprej sterilizirali in mehansko skarificirali, nato pa jih prevlekli s polidopaminom, ki omogoča boljšo adhezijo bakterij na površino semena. Po inokulaciji z bakterijo K. sucrofermentans se je okoli semena oblikoval BC matriks, ki je služil kot nosilec funkcionalnih molekul.

Projekt je vključeval tudi dva konkretna primera uporabe sistema. Prvi primer je bil razvoj biološkega pesticida proti žuželkam iz reda Coleoptera. Namesto sintetičnih pesticidov so raziskovalci uporabili toksin Cry3Aa iz bakterije Bacillus thuringiensis, ki specifično deluje proti hroščem. Toksin so združili z domeno za vezavo celuloze cipA, kar je omogočilo njegovo stabilno pritrditev na BC. V bioloških testih z mokarji so pokazali, da sistem povzroča pomembno zmanjšanje hranjenja in telesne mase žuželk, čeprav smrtnost ni bila zelo visoka. To kaže, da lahko BC prevleka učinkovito zaščiti seme že s preprečevanjem hranjenja škodljivcev. Pomembna prednost sistema je tudi visoka selektivnost toksina Cry3Aa, saj ta deluje predvsem na specifične receptorje pri Coleoptera in ne predstavlja večjega tveganja za sesalce ali večino drugih organizmov. Drugi primer uporabe je bil usmerjen proti parazitski rastlini Striga hermonthica, ki predstavlja resen problem pri pridelavi žit v podsaharski Afriki. Raziskovalci so uporabili spojino X, ki zavira kalitev semen Strige. Ključni problem pri uporabi takšnih spojin je njihova hitra razgradnja in razredčenje v tleh. BC prevleka je v tem primeru delovala kot sistem za počasno sproščanje, ki spojino lokalizirano sprošča neposredno v rizosfero semena. Učinkovitost sproščanja so preverili z uporabo avksotrofnega seva E. coli, ki za rast potrebuje spojino X. Rezultati so pokazali, da BC učinkovito zadržuje in postopno sprošča biološko aktivne koncentracije spojine.

Pomemben vidik projekta je bila tudi integracija družbenih in podjetniških komponent. Ekipa je sodelovala s kmeti, proizvajalci bakterijske celuloze, strokovnjaki za regulativo, materialnimi znanstveniki in predstavniki semenske industrije. Povratne informacije deležnikov so pomembno vplivale na izbiro organizmov, načrtovanje bioreaktorskega sistema in izbiro potencialnih aplikacij. Poleg tega je ekipa razvila tudi poslovni model ter analizirala možnosti komercializacije tehnologije.

Zaključek

Projekt BCoated tako predstavlja celovit primer sodobnega pristopa sintetične biologije k reševanju problemov trajnostnega kmetijstva. Njegova glavna inovacija je modularna platforma, ki omogoča kombinacijo biorazgradljivega materiala, programabilnih bioloških funkcij in kontroliranega sproščanja aktivnih spojin. Raziskovalci vidijo velik potencial sistema ne le pri zaščiti semen, temveč tudi v širši uporabi bakterijske celuloze kot funkcionalnega biomateriala v drugih biotehnoloških aplikacijah.

vir: https://2025.igem.wiki/wageningenur/description/index.html "