Določanje zvijanja RNA in nastanek RNP-kompleksov z mikroskopijo

From Wiki FKKT
Jump to navigationJump to search

Uvod

Sekundarna in terciarna struktura RNA se formirata že med transkripcijo in nastajata skupaj s sproščanjem nascentne RNA iz RNA polimeraznega kompleksa. Struktura RNA ima esencialno vlogo pri regulaciji transkripcije, procesiranju mRNA, izrezovanju intronov, regulaciji izražanja genov. Za njihovo preučevanje se poslužujemo monomolekularnih mikroskopskih tehnik, ki nam omogočajo spremljanje formacije RNA strukture v realnem času, določanje sekundarnih motivov, interakcije s proteini, časovni okvir transkripcije...

Metode

smFRET

smFRET (single-molecule Förster resonance energy transfer) je aplikacija FRET(Förster resonance energy transfer) na molekularnem nivoju za spremljanje zvijanja nascentne RNA med transkripcijo RNA iz DNA matrice. Poslužuje se pojava FRET pri katerem pride do prenosa energije med dvema različnima kromatoforama. Energija se preko interakcij dipol-dipol prenese iz donorske kromatofore, z višjo eksitacijsko frekvenco, ki je v vzbujenem stanju, na akceptorsko kromatoforo z nižjo eksitacijsko frekvenco, ki preide v vzbujeno stanje in nato izseva foton svetlobe. Učinkovitost prenosa energije upada s šesto potenco razdalje, zaradi česar je FRET močno občutljiv na spremembe v razdalji kromatoforama. Občutljivost FRET je 3 - 8 nm in se uporablja za detekcijo spremembe razdalje med dvema bližnjima molekulama in posameznima mestoma v eni molekuli. Inkorporacija fluorokroma na željenem mestu v RNA je dosežena z iniciacijo transkripcije v odsotnosti določenega nukleotida, tako da pride do ustavitve RNA polimeraze pred željenim mestom. Ustavljen transkripcijski kompleks je nato imobiliziran na na površini z biotinilirano DNA matrico ali RNA polimerazo. Fluorokromi so inkorporirani v RNA z modificiranimi nukleotid trifosfati(NTP). Modificirani nukleotid trifosfati se dodajajo ločenih zaporednih korakih, da se prepreči inkorporacija modificiranih NTP na neželjenih mestih, kar pa je v praksi neučinkovito in omejuje analizo na mesta bližini 5’ konca nascentne RNA. SmFRET se lahko uporablja za zaznavo motivov kot so lasnica, pseudovozel, G-četvorček, i-motiv, R-zanka in preučevanje delovanja ribo-stikal.

SiM-KARST

Pri SiM-KARST (single-molecule kinetic analysis of RNA transient structure) spremljamo interakcijo med fluorescenčno označenim oligonukleotidom in nascentno RNA. Dostopnost RNA za vezavo nukleotida služi kot posrednik za merjenje zvijanja RNA,kjer velja, da določena kinetika vezave oligonukleotida korelira specifični konformaciji RNA. Podobno kot smFRET se tudi SiM-KARST poslužuje FRET svetlobnega signala, namesto para modificiranih NTP, pa sta fluorescenčno označena oligonukleotid in nastajajoča RNA, prednost tega pristopa pa je da se z uporabo fluorescenčno označenega oligonukleotida izognemo neučinkoviti inkorporaciji modificiranih NTP.

Vektorska analiza zvijanja

Vektorska analiza zvijanja (vector folding assay)temelji na spremljanju zvijanja proste RNA z FRET, ki služi kot model zvijanja nascentne RNA. Od drugih monomolekularnih metod pa se razlikuje v tem, da ne spremlja zvijanja nascentne RNA, ampak že sintetizirane proste verige RNA, ki se prosti iz RNA:DNA hibrida, ki ga razcepi RepX helikaza. Vektorska analiza zvijanja poteka po naslednjem postopku: RNA veriga v RNA:DNA hibridu je imobilizirana s koplementarnim oligonukleotidom, ki je z biotinom pritrjen na površino. S fluorokromom sta označena RNA veriga in oligonukleotid, ki jo imobilizira. RepX helikaza nato razcepi RNA:DNA hibrid in sproščena RNA veriga se zvije. Konforacijo RNA verige se spremlja z intenziteto svetlobnega signala FRET, ki je odvisna od razdalje med fluorokromoma. Slabost te metode je, da se nastale konformacije pri zvijanju nastajajoče nascentne RNA lahko razlikuje od konformacije celotne proste RNA, ki nastane ob razvitju s RepX helikazo, zaradi česar lahko prihaja do razlik z nativno strukturo RNA.

Dvojna optična past

Pri tej metodi sta dve stekleni ali polistirenski kroglici z laserskim žarkom imobilizirani v raztopini s konstanto silo nekaj pN na medsebojni razdalji nekaj nm. Na kroglicah sta imobilizirani RNA polimeraza in komplementarni oligonukleotid, ki veže nascentno RNA. Ker sta kroglici imobilizirani s konstantno silo, so spremembe razdalje med kroglicama neposredno odvisne od sil, ki nastajajo kot posledica podaljševanja in zvijanja nascentne RNA. Z merjenjem razdalje med kroglicama v odvisnosti od časa lahko v realnem času spremljamo transkripcijo in zvijanja nascentne verige RNA.Pozitivni naklon grafa nakazuje na rast nascentne RNA, negativni naklon nakazuje hkratno rast in zvijanje nascentne RNA(do krajšanja pride ker v primeru rasti pride do podaljšanja za 1 nukleotid, v primeru zlaganja pa ob povezavi dveh nukleotidov pride do skrajšanja za 2 nukleotida), vodoraven graf pa pomeni ustavitev transkripcije.

smPIFE

smPIFE (single-molecule protein induced fluorescene enhancement) temelji na ojačitvi fluorescence ob vezavi proteina v neposredno bližino(0 – 3 nm) cijaninskega barvila, do katere pride zaradi spremembe okolja, prisotnosti viskozne molecule pride do stabilizacije fotoaktivne trans konformacije barvila ob vezavi proteina, kar povzroči 2 – 3x intenziteto izsevane svetlobe. SmPIFE se lahko uporablja za določanje celotnega časa transkripcije RNA z označitvijo konca DNA s fluoroforom. Lahko se kombinira tudi s smFRET, pri čemer je protein označen s fluorokromom

Viri

  • Andrés Bustamante, Tucker J. Carrocci, David A. Nicholson, Margaret L. Rodgers, Nascent RNA Folding and RNP Assembly Revealed by Single-molecule Microscopy, Journal of Molecular Biology, Volume 438, Issue 1, 2026, 169365, ISSN 0022-2836, https://doi.org/10.1016/j.jmb.2025.169365.
  • Fukuda, Shingo, et al. “The Biogenesis of SRP RNA Is Modulated by an RNA Folding Intermediate Attained during Transcription.” Molecular Cell, vol. 77, no. 2, Jan. 2020, pp. 241-250.e8. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1016/j.molcel.2019.10.006.
  • Lee, Chun-Ying, and Sua Myong. “Probing Steps in DNA Transcription Using Single-Molecule Methods.” Journal of Biological Chemistry, vol. 297, no. 3, Sept. 2021, p. 101086. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1016/j.jbc.2021.101086.
  • Lisica, Ana, and Stephan W. Grill. “Optical Tweezers Studies of Transcription by Eukaryotic RNA Polymerases.” Biomolecular Concepts, vol. 8, no. 1, Mar. 2017, pp. 1–11. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1515/bmc-2016-0028.
  • Hua, Boyang, et al. “Real-Time Monitoring of Single ZTP Riboswitches Reveals a Complex and Kinetically Controlled Decision Landscape.” Nature Communications, vol. 11, no. 1, Sept. 2020, p. 4531. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1038/s41467-020-18283-1.
  • Wikipedia contributors. (2026, April 6). Förster resonance energy transfer. In Wikipedia, The Free Encyclopedia. Retrieved 18:34, May 1, 2026, from https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=F%C3%B6rster_resonance_energy_transfer&oldid=1347474509
Retrieved from "https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Določanje_zvijanja_RNA_in_nastanek_RNP-kompleksov_z_mikroskopijo&oldid=26098"