NRPieceS
NRPieceS je projekt ekipe študentov iz Marburga v Nemčiji, ki je dosegel nagrado za najboljšo zbirko delov, najboljši projekt na področju kužnih bolezni in najboljši program, uvrščen pa je bil tudi med najboljših 10 na iGEM tekmovanju.
Uvod
Predvideva se, da bo antimikrobna rezistenca do leta 2050 postala glavni vzrok smrti na svetu, kar pomeni, da bo ena oseba zaradi tega umrla približno vsake 3 sekunde. Ta pojav imenujejo tudi tiha pandemija. Zanjo so v večini dgovorne t. i. ESKAPE bakterije, kamor spadajo Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa in Enterobacter species. Za borbo proti antimikrobni rezistenci je ključno čim hitrejše in učinkovitejše odkrivanje novih protimikrobnih učinkovin. Cilj je bil razviti inovativen pristop za pospešitev odkrivanja novih alternativ klasičnim antibiotikom. Obrnili so se na neribosomske peptid sintetaze (NRPS), ki jih že naravno vsebujejo določene bakterijske vrste. Gre za velike modularne encime, kjer ima vsak modul točno določeno funkcijo za selekcijo, aktivacijo in dodajanje ustrezne aminokisline na rastočo peptidno verigo, določena kombinacija in zaporedje modulov pa omogoči sintezo točno določenega neribosomnega peptida (NRP). S kombinacijo NRPS modulov iz različnih organizmov bi lahko ustvarili nove peptide, ki ne obstajajo v naravi in imajo potencialno antimikrobno aktivnost. Idejo so dobili po zgledu drugih znanih biološko aktivnih spojin, kot so penicilin, romidepsin in lovastatin, katerih sintezo katalizirajo NRPS. Trenutno je že več kot 20 NRP odobrenih za uporabo v medicini. Pri sintezi neribosomnih peptidov se poleg 20 proteinogenih aminokislin lahko uporabijo tudi druge aminokisline, poleg tega so sintetizirani peptidi lahko linearni ali ciklični, aminokisline pa zaradi možnosti epimerizacije v njih nastopajo tako v L kot v D konfiguraciji, kar da izredno raznolike možnosti sinteze novih NRP. Ekipa študentov je razvila sinteznobiološko platformo NRPieceS, ki omogoča enostavno ustvarjanje vellikih knjižnic NRP. Osnova je kombinatorična sintezna knjižnica, ki omogoča načrtovanje in sintezo novih peptidov z uporabo NRPS. Zbirka NRPieceS vsebuje 160 plazmidov. Za enostavnejše načrtovanje novih NRPS so ustvarili tudi program mATChmaker.
Izdelava NRPieceS knjižnice
Za osnovo knjižnice so uporabili nukleotidna zaporedja za 5 nativnih NRPS, ki katalizirajo sintezo cikličnih peptidov, vendar so zaradi visoko ponavljajočih se zaporedij s PCR uspešno pomnožili le 4 zapise za NRPS, kasneje se ena od preostalih NRPS tudi ni uspešno izražala. Delo so zato nadaljevali le s tremi NRPS. Osredotočili so se na ciklične peptide, ker se ti na tarče vežejo z več kontaktnimi točkami kot linearni peptidi, kar jim poveča afiniteto vezave. Ta lahko doseže rede velikosti, ki jih najdemo pri protitelesih. Zapise za nativne NRPS so vstavili v ekspresijske vektorje. Sestavili so še 35 donorskih vektorjev, izmed katerih je vsak nosil zapis za en modul za izmenjavo, in akceptorske vektorje, znotraj katerih je bila na točno določenih mestih omogočena enostavna izmenjava modulov.
Ker so zaporedja za nativne NRPS dolga več deset kbp, so za vstavljanje v vektorje in transformacijo gostiteljskih celic neprimerna. Zato so njihove zapise razcepili na 3 dele in vsakega vstavili v enega od plazmidov pACYC, pCOLA in pCDF, ker so ti optimizirani za ekspresijo proteinov z večplazmidnimi sistemi v E. Coli. To omogoča hkratno transformacijo E. Coli z vsemi tremi plazmidi in izražanje NRPS. Vsak plazmid nosi gen za rezistenco na drug antibiotik za selekcijo in rast le tistih celic, ki so hkrati sprejele vse 3 plazmide. Zapisi za NRPS so bili razdeljeni na XUTI (eXchange Unit) mestih na 3 segmente: iniciacijski, elongacijski in terminacijski. Tako so dobili 9 vektorjev z razcepljenimi zapisi za nativne NRPS. Ekspresijska kaseta za nativne NRPS vključuje inducibilen araBAD promotor, RBS, zapise za razcepljene inteine, ki se nahajajo na ustreznih koncih inserta, in terminator. Razcepljeni inteini omogočijo posttranslacijsko sestavljanje treh polipeptidnih verig NRPS v en funkcionalen encim. Vnos arabinoze v celico se lahko zgodi, ker se v bakterijah po transformaciji izražata arabinozni transporter AraE in regulator AraC pod konstitutivnim promotorjem in sta zapisana na vseh treh plazmidih.
NRPieceS knjižnici so dodali še akceptorske vektorje. Njihova osnova so bili na 3 dele razdeljeni zapisi za nativne NRPS, na identificiranih mestih XUTI znotraj zaporedij pa so uvedli restrikcijska mesta za BsaI in ekspresijsko kaseto za mCherry namesto posameznih modulov. Ta mesta so namenjena izmenjevanju modulov NRPS in v primeru, da sta restrikcija in ligacija pravilno potekli, se iz zapisa za NRPS izreže kaseta za mCherry in kolonije bakterij bojo bele barve. To služi za hitro vizualno identifikacijo ustreznih bakterijskih kolonij. Hkrati so skonstruirali tudi donorske vektorje z NRPS moduli, ki se jih lahko zamenjuje z moduli na mestih XUTI. Zamenjava katerega izmed modulov bi povzročila spremembo aminokislinskega zaporedja NRPS, s tem pa tudi spremenila zaporedje končnega peptida. Konstrukcija teh treh vrst vektorjev je bila izvedena s sestavljanjem Gibsonu. Posamezne module v akceptorskih vektorjih so izmenjevali z Golden Gate metodo.
Izražanje NRPS
Po sestavljanju NRPieces knjižnice so testirali ekspresijo novoustvarjenih NRPS. Kot gostiteljski organizem so izbrali E. Coli. Izbrali so jo, ker je enostavno dostopna in genetsko precej sorodna bakterijam iz rodov Photorhabdus in Xenorhabdus, ki naravno izražajo NRPS. V njej so izražali tako že poznane NRPS, ki so prisotne v naravi, kot novoustvarjene NRPS, ki so jih dobili ali s kombiniranjem delov razcepljenih zapisov za nativne NRPS ali z izmenjavo posameznih modulov. Ustvarili so knjižnico hibridnih NRPS, ki so jih dobili s kombinacijo delov razcepljenih nativnih NRPS in NRPS, ki so jim izmenjali posamezne module. Za induciranje izražanja NRPS so v gojišča dodali arabinozo. Za negativno kontrolo so bakterije nanesli na gojišče brez arabinoze. Ob uspešni ekspresiji se iz vsakega plazmida izrazi del NRPS skupaj z inteini. Inteini sprožijo samoizrezovanje in sestavljanje NRPS v celoto, funkcionalna NRPS pa katalizira sintezo NRP. Iz prisotnosti produkta, ki ga pričakujemo z določeno NRPS, se sklepa na uspešno izražanje. Da bi bile meritve čim bolj zanesljive in ponovljive, so za določanje prisotnosti in količine nastalih peptidov uporabljali LC-MS s kalibracijskimi krivuljami, slepimi vzorci in dodatnimi kontrolami. Za čiščenje vzorcev so se poslužili HPLC ter NMR analize za dodatno oceno čistosti in potrditev strukture produkta.
Testiranje antimikrobne aktivnosti
Nastale NRP so testirali proti ESKAPE bakterijam, ki so odporne na antibiotike. V praksi so testiranje izvedli na določenih bakterijah iz te skupine, v nekaterih primerih pa so uporabili njim sorodne organizme. Peptide so testirali tudi na visokoobčutljivem sevu Bacillus subtilis, ki se tipično uporablja za zaznavanje nizkih koncentracij antibiotikov. Posamezno vrsto bakterije so razmazali na ploščo s trdnim LB gojiščem. Nato so nanjo v ustreznih razmikih nakapali posamezne kapljice ekstraktov NRP. Eksperiment so ponovili tudi z diski filtrirnega papirja, prepojenimi z ekstrakti. To so čez noč inkubirali in naslednji dan opazovali velikosti lis, kjer bakterije niso zrasle. Za pozitivno kontrolo so uporabili gentamicin s koncentracijo 10 mg/mL, za negativno kontrolo pa ekstrakte neinduciranih kultur in kultur, ki so vsebovale plazmide brez zapisov za NRPS. Ker so skoraj vsi testirani ekstrakti dali pozitivne rezultate, so sklepali, da so ti lažno pozitivni. Ugotovili so, da so v ekstraktih prisotni antibiotiki iz gojišč in so zato transformirane bakterije namnožili v gojiščih brez antibiotikov in eksperiment ponovili. Ob ponovitvi testiranja so jim izmed 63 NRP, ki so jih sintetizirale NRPS z izmenjanimi moduli, dali pozitiven rezultat 4 vzorci. NRPS, ki so jih ustvarili s kombiniranjem razcepljenih zapisov nativnih NRPS, niso dale nobenega pozitivnega rezultata. Opazili so tudi razliko med grampozitivnimi in gramnegativnimi bakterijami. Slednje so bile na antibiotike manj občutljive, najverjetneje zaradi dodatne zunanje membrane, ki je oteževala vnos antibiotikov v celice. Zato so želeli preizkusiti še drugačen način dostave NRP.
Dostava NRP v bakterije
Za dostavo NRP v celice so se odločili za strategijo trojanskega konja. To pomeni, da so antimikrobne peptide vezali na druge molekule, ki jih bakterije naravno transportirajo v celico. Tako se antimikrobne učinkovine izognejo obrambnim mehanizmom bakterije in pridejo do tarče v večji količini. Skupina je poskusila z vezavo NRP na sideroforje s klik kemijo. Tak pristop zahteva prisotnost komponent s funkcionalnimi skupinami, kot so terminalni alkini in azidi. Za ta namen so sintetizirali amid, ki vsebuje kateholno in alkinsko skupino. Prva deluje kot siderofor in se koordinira na Fe3+ ione za olajšan vnos v bakterije, druga pa omogoča izvedbo klik reakcije. Pripravli so tudi donorski vektor, ki nosi zapis za modul NRPS, ki v NRP omogoči dodajanje 4-azido-L-fenilalanina (AzF). Tega so vključili na zadnjo možno pozicijo v zapisu za NRPS na terminacijskem plazmidu. Za vezavo NRP na siderofor so izvedli z bakrom katalizirano azid-alkin cikloadicijo. Katalitsko aktiven Cu(I) so razvijali in situ z redukcijo CuSO4 z natrijevim askorbatom v prisotnosti THPTA, ki stabilizira Cu(I). Z LC-MS so potrdili nastanek želenih produktov, zaradi časovne stiske pa niso uspeli testirati učinkovitosti vnosa na siderofor vezanih NRP v bakterije.
Zaključek
V okviru študentskega projekta NRPieceS je bila izdelana knjižnica plazmidov, ki omogočajo hitrejše načrtovanje, izražanje in testiranje protimikrobne aktivnosti novih NRP, ki v naravi ne obstajajo. Ustvarili so 9 ekspresijskih plazmidov, ki vsebujejo razcepljene zapise za 3 nativne NRPS, 9 akceptorskih plazmidov in 35 donorskih plazmidov z zapisi za posamezne NRPS module, ki se jih lahko izmenjuje z moduli na določenih mestih v 9 akceptorskih plazmidih. S kombinacijo delov posameznih nativnih NRPS in izmenjavo modulov so uspešno sestavili in karakterizirali 105 plazmidov z zaporedji, ki kodirajo za nove NRPS. Od tega so uspešno izrazili 95 NRPS, antimikrobno aktivnost pa so preverjali 93 novim NRP in kot učinkovite proti ESKAPE bakterijam identificirali 4 NRP.
