Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih

Izhodiščni članek: Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models

Uvod

Obstoječe metode za zdravljenje raka, kot sta kemoterapija in radioterapija, so povezane s številnimi stranskimi učinki, ki so predvsem posledica njihovega sistemskega delovanja. Nasprotno pa tarčna dostava zagotavlja povišano koncentracijo terapevtske učinkovine v želenem tumorskem tkivu, s čimer je dosežena višja terapevtska učinkovitost in večja selektivnost za rakavo tkivo. Kot rešitev za tarčno dostavo so bili predlagani številni dostavni sistemi: nanodelci (liposomi, polimeri, dendrimeri, kovinski nanodelci), celično osnovani dostavni sistemi (npr. CAR-T, MSC), bakterijski sistemi, konjugati protiteles in zdravil (ADC), eksosomi in drugi zunajcelični vezikli, itd [1]. Bakterije kot dostavni sistem imajo nekatere prednosti v primerjavi z ostalimi, kot sta sposobnost selektivne kolonizacije tumorjev in zmožnost lokalne proizvodnje terapevtskih učinkovin v tumorskem tkivu, kar zagotavlja tarčno in učinkovito dostavo. Pri uporabi bakterij, kot dostavnega sistema za terapevtske proteine, je ključnega pomena razvoj gensko spremenjenih bakterij z genetskim vezjem, ki omogoča oddaljen nadzor nad aktivnostjo vezja [2]. Kot induktorji, ki zagotavljajo oddaljeno aktivacijo izražanja zapisov za terapevtske proteine, se uporabljajo kemični signali, svetloba in ultrazvok. Med slednjimi se je ultrazvok izkazal za najprimernejšega zaradi lastnosti, kot so neinvazivnost, prostorsko-časovna natančnost, varnost in sposobnost prodiranja v tkiva. Takšna genetska vezja, ki se odzivajo na ultrazvočno stimulacijo, s kratico imenujemo SINGER (angl. Sono-activatable Integrated Gene Circuit). Uporaba SINGER vezij v kombinaciji z bakterijami, ki selektivno kolonizirajo tumor, predstavlja obetaven pristop za zdravljenje tumorjev [3].

Razvoj sinteznobiološkega sistema z vezjem SINGER v bakteriji S. typhimurium VNP20009 za dostavo terapevtskih proteinov azurina in PD-L1 nb

V študiji so Gao in sodelavci razvili sinteznobiološki sistem, namenjen zdravljenju tumorjev [3]. Za šasijo so izbrali oslabljen sev Salmonella typhimurium VNP20009 (v nadaljevanju S. typhimurium), za katerega je bila predhodno dokazana selektivna kolonizacija tumorskih tkiv in varna uporaba pri ljudeh [4]. Genetsko vezje so vnesli v S. typhimurium v obliki plazmida. Vezje je bilo zasnovano za tarčno in na ultrazvok odzivno dostavo dveh terapevtskih učinkovin za zdravljenje raka: azurina in nanotelesa, ki se veže na PD-L1 (PD-L1 nb). V prvem koraku so raziskovalci razvili SINGER vezje za učinkovito izražanje zapisa za terapevtski protein in njegovo izločanje v tumorsko tkivo. Optimizirano vezje so nato uporabili za proizvodnjo izbranih terapevtskih proteinov ter ovrednotili lokalno in sistemsko učinkovitost ter varnost takšne terapije [3].

Optimizacija SINGER vezja

Njihov prvi cilj je bil zasnovati optimalno SINGER vezje za izražanje zapisa za terapevtski protein pri povišani temperaturi, ki jo povzroči ultrazvočna stimulacija, ter omogočiti njegovo izločanje v okoliško tumorsko tkivo. Ključno komponento zasnovanega SINGER vezja predstavlja termosenzitivni transkripcijski represor TlpA₃₉, ki pri normalni telesni temperaturi (37 °C) tvori homodimer in deluje kot represor ob vezavi na pripadajoči promotor P_tlpA. Ko temperatura okolja doseže 39 °C, dimer razpade v monomerne podenote in s tem izgubi represorsko funkcijo. Z uporabo represorja TlpA₃₉ in njegovega pripadajočega promotorja P_TlpA so zagotovili možnost oddaljene aktivacije genetskega stikala. Zasnovano genetsko vezje vsebuje dve transkripcijski enoti. V prvi si od leve proti desni sledijo naslednji biološki deli: P_TlpA (sintetični himerni promotor, ki vsebuje O_TlpA regijo za vezavo aktivnega represorja TlpA₃₉), RBS3, YopE-tag_1-15 (kratka N-terminalna fuzijska oznaka s 15 aminokislinami, ki omogoča izločanje fuzijskega proteina v zunajcelični matriks), zapis za želeni terapevtski protein in terminator. Druga transkripcijska enota vsebuje: P_j23100 (konstitutivni promotor), RBS, zapis za TlpA₃₉ (termosenzitivni represor) in terminator. Posamezni biološki elementi (PtlpA₃₉, RBS3, YopE-tag_1-15, P_j23100, TlpA₃₉) so bili vključeni v končno optimizirano SINGER vezje na podlagi premišljenega izbora v okviru optimizacijskih raziskav. Tako zasnovano vezje SINGER omogoča visoko učinkovitost proizvodnje terapevtskega proteina po indukciji z ultrazvokom ter zagotavlja nizko bazalno aktivnost v odsotnosti induktorja [3].

Optimizacija preostalih dejavnikov za učinkovito izražanje zapisa za terapevtski protein

Po izbiri optimalnih komponent vezja je sledila še optimizacija drugih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje zapisa za terapevtski protein. Osredotočili so se na trajanje, moč in način dovajanja ultrazvočnega valovanja. Z uporabo reporterske kasete LuxCDABE in spremljanjem bioluminiscenčnega signala so ugotovili, da je za stabilen dvig temperature na 39 °C potrebna enourna stimulacija s pulznim vzorcem (1 s vklopljeno, 1 s izklopljeno) pri intenziteti valovanja 0,5 W/cm². Takšen režim dovajanja ultrazvočnega valovanja omogoča stabilen dvig temperature na 39 °C in s tem učinkovito izražanje, pri čemer valovanje ne vpliva na viabilnost bakterijskih celic, prav tako pa ne škoduje tumorskim ali zdravim okoliškim celicam [3].

Učinkovitost terapije v mišjih tumorskih modelih

Po pridobitvi optimalnega SINGER vezja in določitvi režima ultrazvočne indukcije izražanja je sledilo ovrednotenje njegovega delovanja v mišjih modelih. Natančneje so v mišje modele seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10 intratumorsko injicirali bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom SINGER-LuxCDABE (reporterska kaseta LuxCDABE pod nadzorom inducibilnega promotorja P_TlpA). V raziskavi so potrdili sposobnost proliferacije S. typhimurium znotraj tumorja ter učinkovito izločanje reporterskega proteina v ECM. Tako je bila razvita platforma za dostavo terapevtskih proteinov, azurina in PD-L1 nb. Sprva so kot terapevtsko učinkovino načrtovali uporabo azurina, pozneje pa so, z namenom širšega terapevtskega dosega in zaviranja metastaz, poleg azurina vključili še PD-L1 nb [3].

Azurin kot terapevtski protein

Dokazali so, da S. typhimurium, transformirana s plazmidnim konstruktom SINGER z vstavljenim genom za azurin (SINGER-azurin), ob ultrazvočni indukciji učinkovito izloča azurin v zunajcelični prostor. Da bi potrdili, da izločeni azurin inducira apoptozo tumorskih celic, so po indukciji z ultrazvokom in centrifugiranju supernatanta izpostavili tumorskim celicam. Testi celične viabilnosti so pokazali statistično značilno razliko v številu apoptotskih celic med vzorcem in kontrolo. Ob intratumoralni dostavi S. typhimurium, transformirane s SINGER-azurin, v miši seva C57BL/6 z melanomskim tumorjem B16F10, in po ultrazvočni stimulaciji, so potrdili izražanje zapisa za azurin v tumorskem mikrookolju ter remisijo tumorja. Eksperimentalno so določili tudi optimalni režim ultrazvočne indukcije, kot kompromis med učinkovito indukcijo izražanja zapisa za terapevtski protein in varnostjo za tkivo. Kot najustreznejši se je izkazal režim: enourna lokalna stimulacija tumorja z ultrazvokom vsak drugi dan, ki je vodila do popolne remisije tumorja. Ker je lahko intratumoralna dostava zaradi anatomske lege tumorjev včasih tvegana ali nepraktična, so preizkusili tudi intravensko dostavo. Dva dni po intravenski aplikaciji S. typhimurium, transformirane s SINGER-LuxCDABE, so kvantificirali biodistribucijo bakterijskih celic in dokazali njihovo prisotnost izključno v tumorskem tkivu, in tako potrdili tarčno kolonizacijo tumorja. Z nadaljnjo intravensko aplikacijo S. typhimurium, transformirane s SINGER-azurin, so v istem mišjem modelu po ultrazvočni indukciji dokazali lokalno izločanje azurina in opazili statistično značilno povečanje deleža apoptotskih celic v primerjavi s kontrolo. Učinkovitost vezja SINGER-azurin so nadalje preverili tudi v mišjih modelih z drugimi vrstami tumorjev: kolorektalnim karcinomom CT26, limfomom B-celic A20 in hepatocelularnim karcinomom H22. Vse miši so bile zdravljene s prej opisanim sistemom – S. typhimurium s SINGER-azurin vezjem in ultrazvočno indukcijo. V modelih CT26 in A20 so dosegli popolno regresijo tumorjev, medtem ko je bilo pri H22 tumorsko tkivo še delno prisotno [3].

PD-L1 nb kot terapevtski protein

Z namenom, da bi bila terapija primerna za zdravljenje oziroma popolno izkoreninjenje širšega spektra rakavih obolenj, vključno s hepatocelularnim karcinomom H22, so v optimizirano vezje SINGER kot terapevtski protein vključili PD-L1 nb, ki ima imunostimulacijski učinek. Vezje SINGER, ki vsebuje terapevtski PD-L1 nb (SINGER-PD-L1), je bilo po enakem postopku kot SINGER-azurin testirano za potrditev lokalnega izločanja v tumorju in terapevtske učinkovitosti. Ob intravenski aplikaciji enakega deleža S. typhimurium, transformirane s SINGER-azurin in SINGER-PD-L1 (sistem, poimenovan SINGER-2), v miši seva C57BL/6 s hepatocelularnim karcinomom H22, so dosegli popolno remisijo tumorja. Za mišji model hepatocelularnega karcinoma H22 je značilno metastaziranje, predvsem v bezgavke. Ob prejemu terapije SINGER-2 se je poleg inhibicije primarnega tumorja tudi preprečeno metastaziranje v bezgavke. Poleg tega so ocenili tudi sistemski imunski odziv organizma na tumor, pri čemer so analizirali prisotnost in količino specifičnih imunskih celic v vranici in regionalnih bezgavkah. Zabeležili so povišanje števila imunskih celic s protitumorsko aktivnostjo ter zmanjšanje deleža celic s protumorskim učinkom [3].

Zaključek

Razvit sinteznobiološki sistem, zasnovan z uporabo bakterije S. typhimurium, transformirane s plazmidnim konstruktom s SINGER vezjem, predstavlja obetaven terapevtski pristop za zdravljenje raka. Sistem odlikujejo tarčno in lokalno delovanje, možnost inducibilne regulacije z ultrazvokom, varnost za gostitelja ter prilagodljivost pri izbiri terapevtskih proteinov.

Literatura

[1] X. Liu, Y. Cheng, Y. Mu, Z. Zhang, D. Tian, Y. Liu, X. Hu, T. Wen: Diverse drug delivery systems for the enhancement of cancer immunotherapy: an overview. Front. Immunol. 2024, 15.
[2] X. Zhao, N. Xie, H. Zhang, W. Zhou, J. Ding: Bacterial Drug Delivery Systems for Cancer Therapy: “Why” and “How”. Pharmaceutics 2023, 15, 2214.
[3] T. Gao, L. Niu, X. Wu, D. Dai, Y. Zhou, M. Liu, K. Wu, Y. Yu, N. Guan, H. Ye: Sonogenetics-controlled synthetic designer cells for cancer therapy in tumor mouse models. Cell Reports Medicine 2024, 5, 101513.
[4] W. Chen, Y. Wang, M. Qin, X. Zhang, Z. Zhang, X. Sun, Z. Gu: Bacteria-Driven Hypoxia Targeting for Combined Biotherapy and Photothermal Therapy. ACS Nano 2018, 12, 5995–6005.