Klasifikacija transpozicijskih elementov in pregled načina delovanja

Uvod

Velik delež človeškega genoma sestavljajo transpozoni, ki jih imenujemo tudi transpozicijski elementi. Transpozoni so mobilni genetski elementi, ki se glede na mehanizem transpozicije in reakcijske intermediate delijo na dve večji skupini, DNA transpozone in retrotranspozone. Pri DNA transpozonih gre za dele DNA, ki se lahko premaknejo iz enega dela genoma na drugega. Premik, ki se zgodi, imenujemo transpozicija in ga katalizirajo encimi transpozaze, katerih zapis lahko nosijo kar transpozoni sami. Od drugih poti za premik mobilnih genetskih elementov se razlikuje v tem, da obsežna homologija med DNA sekvencami na koncu transpozona in tarčnim delom DNA, kamor se transpozon ustavi, ni potrebna. Bistvena značilnost premika DNA transpozonov je, da so vsi intermediati reakcije DNA molekule, kar na primer za retrotranspozone ne velja. Da pride do premika transpozona, mora biti prisoten encim transpozaza, ki prepozna inverzni ponovitvi na koncih transpozona in se nanju veže ter prenese transpozon na novo mesto v DNA. Na katero mesto DNA se bo prenesel, je odvisno od vrste transpozona. Pri večini transpozonov tarčo predstavljajo nekaj nukleotidov dolga zaporedja DNA, za katerimi se transpozon lahko vmesti oziroma prilepi. Primer takega zaporedja je TTAA zaporedje, polega katerega se rad veže piggyBac transpozon. Poleg tega zaporedja se prav tako rad integrira v bližino mest začetka transkripcije in v introne znotraj genov. Posledica takega premika je lahko deaktivacija ključnih genov ali njihovih promotorjev. Zgodi pa se tudi, da spremembe v genomu zaradi transpozicije organizmu koristijo. Veliko organizmov je razvilo mehanizme za zatiranje aktivnosti transpozonov, iz česar bi lahko sklepali, da je transpozicija organizmom povzročala več težav kot koristi. Primer mehanizmov za zatiranje so pri evkariontih modifikacije kromatina (DNA metilacija, modifikacija histonov).

Način transpozicije

Transpozoni se med sabo razlikujejo po načinu oziroma mehanizmu premika. Najbolj preučen je mehanizem »izreži in prilepi« (»cut-and-paste«), kjer se transpozon izreže iz enega dela in premakne v drugi del genoma. Gre za dvojni verižni prelom ob koncih transpozona, ki mu rečemo tudi izrez. Pri tem pride do nukleofilnih reakcij, ki pomagajo prekiniti posamezno verigo DNA. Po izrezu in premiku pride do integracije, kjer se transpozon prilepi v nov del DNA, prav tako s pomočjo nukleofilnih reakcij. Na ta način se premikajo tudi prvi znani transpozoni, ki jih je odkrila Barbara McClintock, ko je preučevala spremenljive genetske lokuse pri koruzi. Obstajajo tudi še drugi mehanizmi premika DNA transpozonov, med bolj raziskanimi sta dva, ki vključujeta dodatno DNA sintezo. Pri prvem gre za replikativno transpozicijo »copy-and-paste«, kjer originalen transpozon ostane na prvotnem mestu in se ne izrezuje, njegova kopija pa se premakne na novo mesto genoma. V samem procesu replikativne transpozicije se izoblikuje intermediat Shapiro, v katerem pride do sinteze nove DNA. Drugi bolj raziskan mehanizem premika z dodatno DNA sintezo se imenuje »copy-out−paste-in«, pri katerem pride do kopiranja transpozona in izoblikovanja krožne DNA, ki se prenese na novo mesto v genomu. Pri tem ena veriga originalnega transpozona ostane na prvotnem mestu v genomu in se podvoji, drugi del DNA verige pa se izreže, oblikuje v krožno DNA, se v tem stanju podvoji ter prenese na novo mesto v genomu.

Klasifikacija transpozonov pri prokariontih

Transpozone lahko ločimo glede na to, kje imajo zakodirano transpozazo. Avtonomni DNA transpozoni že vsebujejo gen za transpozazo, medtem ko neavtonomne DNA transpozone mobilizira transpozaza, ki je zakodirana drugje v genomu. Najpreprostejše avtonomne transpozone pri prokariontih imenujemo insercijska zaporedja (IS) in so sestavljena le iz gena za transpozazo in inverznih ponovitev na koncih. Pri bakterijah je bilo identificiranih več kot 4000 različnih IS, ki so dolga 750-3000 bp. Posamezna IS lahko združujemo v družine. Klasifikacija lahko temelji na podobnosti invertinih in direktnih ponovitev, značilnosti njihovih odprtih bralnih okvirjev ali ciljnih zaporedij v katere se vstavljajo. Glede na te značilnosti je trenutno klasificiranih okoli 30 družin IS. Najpomembnejši faktor pri delitvi pa je podobnost v zaporedju za transpozazo. Posamezne družine lahko naprej združujemo v razrede. Pri razlikovanju transpozonov po tipu katalitične domene transpozaze dobimo 4 razrede: DD(E/D) transpozone, Y1 in Y2 transpozone, serinske in DEDD transpozone. DD(E/D) transpozoni so poimenovani po treh ohranjenih negativno nabitih aminokislinskih ostankih v aktivnem mestu transpozaze, kjer je na tretjem mestu najpogosteje glutamat, lahko pa tudi aspartat. V ta razred spada največje število IS, nekateri izmed teh so družine IS1, IS3, IS4 in IS5, ki se delijo še na poddružine. Večina IS z DD(E/D) transpozazo so majhni, genetsko kompaktni segmenti DNA z enim ali dvema odprtima bralnima okvirjema (transpozaza in morda protein, ki sodeluje pri regulaciji). Razred Y1 in Y2 transpozonov je klasificiran glede na transpozazo, ki pripada HUH endonukleazni superdružini (v aktivnem mestu sta histidinska ostanka ločena z velikim hidrofobnim ostankom). Pod HUH endonukleaze spadajta družini Y1 in Y2 transpozaz, ki se razlikujeta glede na število (ena ali dva) tirozinskih ostankov vključenih v katalizo. V razred Y1 spada družina IS200/IS605, v razred Y2 pa spada družina IS91. Družina IS91 je precej homogena, IS200/IS605 pa se deli na tri poddružine: IS200, IS1341 in IS605. V razred serinskih transpozonov spada družina IS607. Pod DEDD transpozone pa spada družina IS110, ki je trenutno edina znana IS družina, ki kodira DEDD transpozazo. Poleg teh štirih večjih razredov pa poznamo tudi številne družine IS, za katere nukleazna domena transpozaze še ni bila identificirana. IS pa se lahko pojavljajo tudi kot gradniki sestavljenih transpozonov, ki nastanejo, ko se IS vstavi na vsako stran enega ali več genov. Sestavljeni transpozoni so še posebej pomembni, če vmesni geni nosijo zapis za npr. odpornost proti antibiotikom. V zvezi s prenašanjem odpornosti na antibiotike pri bakterijah, so bili odkriti transpozoni Tn5, Tn10, Tn3 in Tn7, ki so tudi eni izmed najbolj preučenih transpozonov pri prokariontih. Tn5 in Tn10 sta sestavljena transpozona in se premikata z mehanizmom »izreži in prilepi«. Prav tako oba spadata v razred DD(E/D) transpozonov. Tn5 vsebuje tri gene za rezistenco, Tn10 pa ima rezistenco na tetracikiln. Tn3 je nesestavljeni transpozon, saj na robovih nima IS, pač pa le obrnjeni ponovitvi. Prenaša se po principu replikativne transpozicije (»copy-and-paste«), vsebuje gen za β-laktamazo in spada v razred DD(E/D) transpozonov. Tn7 vsebuje gene za pet encimov, ki sodelujejo pri premiku po »izreži in prilepi« mehanizmu in kodira rezistenco na streptomicin.

Klasifikacija transpozonov pri evkariontih

Prokariontske in evkariontske transpozicijske elemente tradicionalno obravnavamo ločeno, kljub določenim podobnostim v strukturi in mehanizmih delovanja, zato so se razvili tudi različni načini klasifikacije. Najbolj splošna in osnovna delitev evkariontskih transpozicijskih elementov, ki izvira že iz leta 1989, je na dva razreda glede na kemijsko naravo reakcijskih intermediatov (RNA ali DNA). V razred 1 spadajo elementi, ki imajo RNA-intermediate in se imenujejo retrotranspozoni. RNA-intermediat, ki nastane s transkripcijo retrotranspozona, se z reverzno traskripcijo prepiše v DNA in integrira v genom na tarčnem mestu. Pri tem ostane transpozon na svojem mestu, zato take mehanizme transpozicije imenujemo tudi "kopiraj in prilepi". Transpozicijski elementi, uvrščeni v razred 2 pa imajo samo DNA-intermediate transpozicije in jih imenujemo DNA-transpozoni. Transpozicija večinoma poteka po mehanizmu "izreži in prilepi". Razredi se lahko naprej delijo na podrazrede, rede, superdružine in družine. V različnih virih so navedeni klasifikacijski sistemi, ki se med seboj lahko do neke mere razlikujejo po razvrščanju v posamezne zgoraj navedene enote; v nekaterih virih avtorji enačijo pojma podrazreda in reda. Transpozicijski elementi so združeni v podrazrede glede na mehanizem transpozicije in/ali integracije v tarčno DNA. V superdružine in družine pa se uvrščajo na podlagi filogenetskih odnosov.

Retrotranspozoni

Retrotranspozone lahko razdelimo na tri podrazrede: LTR (dolge končne ponovitve), ne-LTR in tirozin rekombinaza (YR) mobilizirane elemente. Kot ločen podrazred lahko obravnavamo tudi elemente Penelope. LTR retrotranspozoni so prevladujoč red pri rastlinah, manj pa pri živalih. Med dolgimi končnimi ponovitvami (250-600 bp) se ponavadi nahajata gena gag (strukturni gen za oblikovanje virusnega delca) in pol (prekurzor, iz katerega se bodo odcepile integraza, reverzna transkriptaza in proteaza). LTR-elementi so strukturno podobni retrovirusom in imajo tudi do neke mere podoben način razširjanja v genomu. YR-mobilizirani elementi so podobni LTR, a vsebujejo gen za tirozinsko rekombinazo namesto integraze. Podrazred ne-LTR retroelementov ponavadi razdelimo na LINE in SINE (dolgi oz. kratki razpršeni jedrni nukleotidni elementi). Do transkripcije tu prihaja s stalnih mest, mehanizem transpozicije pa je drugačen od LTR.

DNA transpozoni

DNA-transpozone delimo na štiri podrazrede: TIR (DDE elementi), Crypton, Helitron in Mavericks (Polinton). Transpozoni iz prvega in drugega omenjenega podrazreda so najpreprosteje zgrajeni; večinoma jih sestavljajo samo inverzne ponovitve in gen za transpozazo. Po strukturi zato spominjajo na insercijska zaporedja pri prokariontih, ki jih sicer pri evkariontih ne imenujemo tako. TIR elementi so pri evkariontih izmed DNA-transpozonov najbolj razširjeni in so razporejeni v okoli 17 superdružin, glede na zaporedje (terminalnih) inverznih ponovitev. Zanje se ponekod uporablja tudi ime DDE elementi (kot pri prokariontih), a so take katalitične domene transpozaz našli tudi pri drugih skupinah transpozonov, zato to poimenovanje ni čisto korektno. Nekatere izmed najbolj znanih superdružin so Tc1-Mariner, hAT in Mutator. Za transpozone v podrazredu Crypton je značilno, da kodirajo za tirozinsko rekombinazo, nimajo pa inverznih ponovitev. Na splošno je o tem razredu še malo znanega. Elementi podrazreda Helitron uporabljajo drugačen mehanizem transpozicije od ostalih, t. i. mehanizem kotalečega se kolesa. Večinoma so neavtonomi, avtonomni predstavniki pa kodirajo za Y2 tip tirozinske rekombinaze (tip katalitične domene transpozaze) in včasih še za druge proteine. Transpozoni iz skupine Maverick so zelo dolgi elementi (10-20 kb), z dolgimi inverznimi ponovitvami in lahko kodirajo tudi do 11 proteinov. Razširjeni so pri različnih vrstah evkariontov, a le v malem številu kopij na genom.

Viri

1. Wicker T, Sabot F, Hua-Van A, Bennetzen JL, Capy P, Chalhoub B, et al. A unified classification system for eukaryotic transposable elements. Nat Rev Genet. 2007;8: 973–982. doi:10.1038/nrg2165

2. Hickman AB, Dyda F. DNA Transposition at Work. Chem Rev. 2016;116: 12758–12784. doi:10.1021/acs.chemrev.6b00003

3. Wells JN, Feschotte C. A Field Guide to Eukaryotic Transposable Elements. Annu Rev Genet. 2020;54: 539–561. doi:10.1146/annurev-genet-040620-022145

4. Siguier P, Gourbeyre E, Chandler M. Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity. FEMS Microbiol Rev. 2014 Sep;38(5):865-91. doi: 10.1111/1574-6976.12067.

5.Reprogramiranje s transpozicijo - Wiki FKKT. http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_s_transpozicijo. Pridobljeno 17. april 2022.