Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb

Uvod

Bakteriofagi so virusi, ki lahko okužijo in ubijejo bakterije ne da bi pri tem poškodovali človeške ali živalske celice. Zato se zdi, da bi jih lahko uporabljali za zdravljenje bakterijskih okužb v kombinaciji z antibiotiki ali same. V modernem svetu je množična uporaba antibiotikov privedla do tega, da so bakterije postale odporne na enega ali več antibiotikov. Poleg tega se je v veliki večini razvoj novih antibiotikov ustavil, kar predstavlja velik problem za zdravljenje bakterijskih okužb. Zato so znanstveniki prišli na idejo, da bi lahko bakteriofage uporabili za njihovo zdravljenje.

Bakterijska odpornost na fage bi z njihovo uporabo verjetno narasla, vendar to ne bi smela biti prevelika skrb, če jo primerjamo z bakterijsko odpornostjo na antibiotike. Fagi rastejo eksponentno in tako zasenčijo bakterijsko rast in zato skupaj z njimi lahko tudi mutirajo. Poleg tega obstaja ogromno vrst fagov, tako bi se tudi za mutirane bakterije našel bakteriofag.

Specifičnost

Mnogi bakteriofagi so že bili opisani in klasificirani. En bakteriofag lahko uniči omejeno število vrst bakterij, pogosto samo eno, kar pomeni da so bakteriofagi zelo specifični. Ko bakteriofag vstopi v celico bakterija začne proizvajati proteine, ki pomagajo pri podvojevanju virusnega dednega materiala. Ko se začne sestavljanje novih fagov so celice lizirane in novi virioni lahko okužijo druge celice.

Bakterijske celice imajo celično steno iz polisaharidov, ki jih varuje pred snovmi iz okolja. Bakteriofagi vstopijo v bakterijsko celico tako, da se pripnejo na specifične receptorje na površini bakterije. Ta specifičnost pomeni, da bakteriofagi lahko okužijo le določene bakterije, ki imajo na površini proteine na katere se bakteriofag lahko veže. To determinira specifičnost bakteriofagov. Specifičnost oz. sposobnost da ubijejo samo patogene, ki jih lahko prepoznajo je najbolj privlačna stvar pri bakteriofagih. Ker so tako specifični ni strahu, da bi bakteriofagi pobili tudi bakterije v našem telesu, ki so človeku koristne.

Da okužijo celico, se morajo fagi adsorbirati na površino gostiteljske celice, predreti celično steno in vbrizgati svoj genetski material vanjo. Več kot 90% fagov je repastih fagov, ki imajo vse potrebno za adsorbcijo v repu. Interakcije med fagi in gostiteljsko celico se pojavijo med repnimi proteini fagov in bakterijskimi receptorji. Te interakcije določajo specifičnost fagov in njihov razpon.

Učinek omejen na mesto infekcije

Ena od večji prednosti zdravljenja s fagi je to, da je potrebno zelo malo odmerkov, v najboljšem primeru celo samo en. Razlog za to je, da se bakteriofagi razmnožujejo le na mestih okužbe. Torej, za razliko od antibiotikov, je učinek bakteriofagov omejen na mesto infekcije in to mesto je dostopno tudi v primeru, ko se bakterija nahaja v organu v telesu ali pa na primer v sistemu, ki ga protimikrobna zdravila težko dosežejo oz. težko vstopijo vanj. Kljub temu da so lahko prisotni tudi mutanti, odporni na fage, so te običajno manj virulentni in posledično ne ogrožajo zdravljenja. Specifičnost infekcije fagov tudi zagotavlja, da večina telesne mikroflore ni prizadeta.

Cenovno ugodnejše

V raziskavi so ugotovili, da je lahko terapija s fagi ugodnejša od uporabe antibiotikov, katerih tarča so patogeni, ki so odporni na več zdravil. Poskus in izračune so naredili za okužbo s strafilokoki oziroma bolj natančno MRSA. MRSA je Strafilokokus Aureus, ki je odporen na antibiotik meticilin. Ker meticilin ne učinkuje pri okužbi, zdravljenje poteka z drugimi antibiotiki, ki so močnejši, posledično pa so tudi dražji. Pokazali so, da je lahko terapija z bakteriofagi morda lahko tudi prva možnosti pri zdravljenju nekaterih infekcij in ne le alternativa, saj je to bolj cenovno prijazno do zdravstvenega sistema, poleg tega pa je učinkovito. Še posebej bi se to poznalo pri kroničnih okužbah, kjer zdravljenje traja dlje in je potrebnih več doz zdravila.

Bakteriofagi so bolj varni in jih telo bolje prenaša

Varnost zdravila je odvisna od možnega vpliva zdravila na ostala telesna tkiva in ne le tarčno tkivo. Kot vemo bakteriofagi ubijajo bakterije. Zanima nas, ali vplivajo na bakterije v črevesju, saj je tam največja koncentracija bakterij v telesu. Črevesni mikrobiom sestavljajo vsi mikroorganizmi (bakterije, glivice, evkarionti in virusi), ki se v nahajajo v črevesju in jih je pri zdravih posameznikih lahko preko 1.000 različnih vrst. Disbioza je pogosta posledica jemanja širokospektralnih antibiotikov, saj učinkujejo na preveliko količino pozitivnih bakterij v črevesju. To je stanje, ko je v črevesju preveč patogenov, med drugim predstavlja tveganje za stanjšanje črevesne sluznice, ki ščiti črevesno steno, da ta lahko normalno opravlja svoje funkcije. Če pride do stanjšanja črevesne sluznice, se pojavijo vnetja na črevesni steni in motnje v delovanju mehanizma, ki v krvni obrok prepušča hranila in preprečuje prehajanje nevarnih snovi v krvni obtok. V nasprotju so bakteriofagi ozkospektralni in imajo zaradi visoke specifičnosti minimalen vpliv na normalen črevesni mikrobiom, tudi če uporabimo koktejl različnih bakteriofagov. Ostali hudi stranski učinki pri antibiotikih so alergije in sekundarne infekcije, ki jih pri bakteriofagih ni, saj so bile živali skozi celotno evolucijo izpostavljene velikemu številu bakteriofagov, zato imajo večjo toleranco do takšnih zdravil. To potrjuje veliko raziskav, v katerih pa ni nikoli prišlo do hujših stranskih učinkov. Poleg tega bi lahko rekli, da so bakteriofagi bolj varni in jih človeško telo bolje prenaša kot antibiotike, saj se podvojujejo le v tarčnih bakterijskih celicah, in ne morejo okužiti sesalskih celic.

Pozitivni učinki bakteriofagov na telo

Raziskovali so kako bi zboljšali zdravje črevesja in zmanjšali težave prebavnih motenj. Bakteriofagi (ob pravilnem izboru le teh) selektivno modificirajo črevesno bakterijsko floro. Zaužitje terapevtske doze štirih različnih bakteriofagov je v raziskavah varno in telo jih uspešno sprejme. Bakteriofagi bi bili lahko uporabni kot prehransko dopolnilo pri posameznikih z prebavnimi težavami, saj raziskave kažejo, da so jih zdravi posamezniki prenesli brez težav. Dokazali so tudi, da redno jemanje bakteriofagov, kot probiotikov (oziroma dodatkom k probiotikom) blagodejno vpliva na mikrofloro in doda zaščito proti patogenom, ki povzročajo diarejo. Bili bi zelo dobra preventiva.

Preprost način vnosa v telo

Možnih je več načinov vnosa in pri nobenem ni večjih težav. Potrebne so zelo majhne doze, saj se koncentracija bakteriofagov na mestu infekcije poveča. Povprečje doz bakteriofagov sega od 1E-10 do 1E-16 g, doze antibiotikov pa merimo v miligramih.

Največ raziskav je bilo opravljenim z oralnim vnosom. Tak način vnosa v telo je zelo preprost. Zaužitje bakteriofagov je možno preko tekočega filtrata bakteriofagov ali tablet. Prebavna cev živali in ljudi je naravno okolje bakteriofagov. Oralno se vnesejo bakteriofagi, ki delujejo v prebavni cevi in pa tudi drugje po telesu, a absorbcija fagov vnesenih oralno v kri majhna. Veliko bolj učinkovit je vnos intravenozno (injiciranje v kri), intraperitonealno (injiciranje v trebušno votlino) ali intramuskularno (injiciranje v mišico). Tak vnos je hiter in vodi do vseh organov in tkiv, a ta način ni še veliko raziskovan.

Zelo uspešen vnos je tudi transdermalno z mikroinjekcijami. Bakteriofagi z napravo za mikroinjeciranje preidejo poroženelo plast kože (najbolj zunanja plast povrhnjice), saj so sami preveliki, da bi jo prešli. Ko jo preidejo gredo dalje do krvi, kjer pa povzročijo največjo koncentracijo bakteriofagov v krvi.

Dodatne koristi po inženirski predelavi in odstranitev biofilma

Sintetična biologija vključuje inženiring bioloških organizmov z uporabo modularnih in posplošenih zasnov. Njihov končen cilj je razvoj koristnih rešitev za probleme, kot je na primer bakterijski biofilm. Biofilm predstavlja skupek mikroorganizmov in njihovih zunajceličnih produktov, ki so pritrjeni na biogeno podlago in velikokrat deluje kot zaščitna plast, tudi kot zaščita proti delovanju antibiotikov. Biofilmi kažejo veliko odpornost na antimikrobna zdravljenja in težko jih je odstraniti iz gostiteljevega imunskega sistema.

Bakteriofagi so lahko inženirsko tako predelani, da lahko premostijo nekatere limitacije zdravljena z antibiotiki. Pri temu pripomore nova, cenovno ugodna tehnologija sekvenciranja DNA velikega formata in sinteza DNA. Dober primer tega je podan z dokazi, da lahko bakteriofagi razpršijo biofilm, tudi v primeru ko je bakterija občutljiva na odmerek nekega zdravila. V in vitro študiji so skonstruirali bakteriofag, ki je učinkovit proti nastajanju biofilma pri E. Coli in ki izraža encim, ki razgrajuje biofilm. Ugotovili so, da je možen sočasen napad bakterijskih celic in matriksa biofilma. Rezultati so bili zelo spodbudni, saj je inženirsko predelan bakteriofag reduciral število bakterijskih celic z biofilmom za približno 99,9%.

Predstavili so modularno konstrukcijo, v kateri so fagi, ki ubijejo bakterije, tako predelani, da izražajo najbolj učinkovit EPS degradacijski encim, ki specifično cilja biofilm. EPS so ekstracelularne polimerne substance, ki so sestavni del biofilma in ga gradijo. Torej, omenjena strategija omogoči razvoj širokega nabora fagov, ki razgrajujejo biofilm, kar je lažje kot da bi tak fag poskušali izolirati iz okolja. Ker bi se fag pomnoževal znotraj biofilma, bi lahko dosegli visoke koncentracije encimov in litičnega faga, kar cilja na več komponent biofilma. S fagi, ki se hitro razmnožujejo, in z encimi, ki razgrajujejo biofilm, bi lahko ta sistem predstavljal učinkovito avtokatalitično metodo za odstranjevanje biofilmov v industrijskih in kliničnih okoljih.

CRISPR-Cas9

Tudi genske modifikacije lahko pomagajo pri boju proti odpornosti bakterij na antibiotike.

CRISPR-Cas9 je enostavna metoda spreminjanja genov, ki omogoča genetikom in medicinskim raziskovalcem da uredijo dele genoma tako, da jih odstranijo in nato dodajo odseke DNA zaporedja. Temelji na sistemu v bakterijah, ki ga uporabljajo za zaščito pred bakteriofagi.

CRISPR-Cas9 sistem sestavljata dve ključni molekuli, ki inducirata spremembo (mutacijo) v DNA. Prva molekula je encim Cas9, ki deluje kot par molekulskih škarij, ki lahko režejo dve verigi DNA na specifičnem mestu v genomu. Druga molekula je del RNA, ki se imenuje vodilna RNA (gRNA). Vodilno RNA zaporedje je narejeno tako da najde in se veže na specifično, komplementarno DNA zaporedje. Vodilno zaporedje usmerja Cas9 na pravilni del genoma in omogoča da reže DNA na želenem mestu.

Ko Cas9 prereže obe verigi DNA, celica opazi napako in poskuša popraviti DNA. Pri tem pa pogosto pride do mutacij Te mutacije so naključne. Če v celico vnesemo odsek DNA , ki nosi želeno zaporedje, se ta lahko veže na odrezane konce in nadomesti prejšnje zaporedje. Tako lahko znanstveniki v celice vnašajo želene mutacije.

Kakšno vlogo imajo tu bakteriofagi? Z metodo CRISPR-Cas9, je mogoče iz bakterij odstraniti gene, ki jih delajo odporne proti zdravilom. Znanstveniki želijo metodo še dodatno nadgraditi z bakteriofagi. Razviti želijo bakteriofag, ki bi v bakterijo vnesel sistem CRISPR-Cas9 in s tem odstraniti odpornost na zdravila - antibiotike.

V raziskavi so z genskim inženiringom zasnovali fage tako, da so odpravili odpornost patogenov na zdravila in posledično povrnili občutljivost bakterij na antibiotike. Namesto da bi fage uporabljali pri bolnikih, so jih uporabili za razpršitev po bolnišničnih površinah, da bi s tem postopoma preprečili pojav odpornih patogenov, ki tekmujejo s patogeni za preživetje.

Viri

Principi N, Silvestri E and Esposito S (2019) Advantages and Limitations of Bacteriophages for the Treatment of Bacterial Infections. Front. Pharmacol. 10:513. doi: 10.3389/fphar.2019.00513

Lu, T. K., and Collins, J. J. (2007). Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11197–11202. doi: 10.1073/pnas.0704624104

What is CRISPR-Cas9? [11. 5. 2020] Dostopno na: https://www.yourgenome.org/facts/what-is-crispr-cas9

Drulis-Kawa, Z., Majkowska-Skrobek, G., Maciejewska, B., Delattre, A.-S., & Lavigne, R. (2012). Learning from Bacteriophages - Advantages and Limitations of Phage and Phage-Encoded Protein Applications. Current Protein and Peptide Science, 13(8), 699–722. doi:10.2174/138920312804871193