Predstavitev na površini bakterij
Predstavitev hipervariabilnih domen težkih verig protiteles kamele na površini po Gramu pozitivnih bakterij
V članku so tehniko predstavitve na površini celic Gram-pozitivnih bakterij Staphylococcus carnosus primerjali s tehniko predstavitve na fagih. Na površini bakterije so kot prvič predstavili knjižnico fragmentov protiteles imenovanih nanotelesca, ki so pravzaprav variabilne domene težkih verig protiteles kamele. V tej raziskavi so bila ta nanotelesca usmerjena proti zelenemu fluorescirajočemu proteinu GFP (antigen). Cilj raziskave je bil odgovor na vprašanje, ali lahko predstavitev knjižnjice nanotelesc na površini bakterij konkurira oziroma dopolnjuje predstavitev na površini fagov. Predstavitev na površini celic se bistveno razlikuje od predstavitve na površini fagov v načinu prebiranja oz. selekcije klonov. Selekcija fagov z vezavnimi molekulami (ki se vežejo na antigen) na svoji površini pri predstavitvi na fagih poteka po načinu afinitetne kromatografije, saj imobilizirani antigeni zadržijo delce z vezavnimi molekulami, kar kasneje eluiramo. Ker so celice bistveno večje od virusov, nam to omogoča detekcijo s pomočjo pretočne citometrije in ločevanje na podlagi fluorescence. Za sortiranje celic, ki imajo na svoji površini izražene rekombinantne proteine so avtorji uporabili tehniko FACS - Flow cytometry and Fluorescence-activated cell sorting. FACS lahko celice poleg analiziranja in štetja še sortira glede na njihove lastnosti. Sortiranje poteka glede na količino in vrsto fluorescence, ki ga posamezna celica odda. Po tem ko gredo celice mimo vira svetlobe, pretočni citometer tok suspenzije spremeni v posamezne kapljice. Vsaka kapljica vsebuje celico. Glede na valovno dolžino in količino oddane fluorescenčne svetlobe določene celice kapljica s to celico v električnem polju prejme določen naboj. Glede na naboj so nato celice fizično ločene. Prvi del eksperimenta je bila predstavitev na površini fagov. V ta namen so najprej sprožili imunski odziv kameljih protiteles proti GFP proteinom in izolirali protitelesa. Sledilo je pripravljanje fagov, ki so nanotelesca proti GFP predstavljali na svoji površini. Selekcija fagov z nanotelesci je potekala z vezavo fagov na imobiliziran GFP in kasnejšo elucijo. Sledilo je sekvenciranje genov za nanotelesca in preverjanje nanotelesc s tehniko ELISA. Preverjanje s tehniko ELISA temelji na preverjanju topnih protiteles, ki jih producirajo fagi, ki smo jih pred tem selekcionirali kot tiste, ki na svoji površini predstavljajo protitelesa, ki se vežejo na želeni antigen. Dejstvo, da poleg nanotelesc ujetih v membrano, nastajajo tudi topna nanotelesca, je posledica tega, da zaradi doseganja monovalentnega izražanja nanotelesc na površini, med gen za nanotelesce in gen III. vstavijo stop kodon, zaradi česar nastajajo tudi manjše količine topnih nanotelesc. Drugi del eksperimenta je predstavljala predstavitev na površini bakterijskih celic. V ta namen so gene za nanotelesca vstavili v vektor za predstavitev na površini bakterijskih celic pSCZ1. Tehnologija predstavitve na površini po Gramu pozitivnih bakterij temelji na tem, da želeni gen vstavimo za gen za domeno stafilokoknega proteina A, ki je usidrana v celično steno. Celice se nato ločujejo s pomočjo pretočne citometrije – metodo FACS. V primeru predstavitve na površini celic, celic ne inkubiramo skupaj z imobiliziranim antigenom za nanotelesca, ampak s topnimi GFP proteini v raztopini, skupaj s topnimi fluorescentno označenimi reporterskimi proteini (HSA), ki se vežejo na ABP protein. Tiste celice, ki torej vežejo GFP in HSA in fluorescirajo nad nekim pragom, pretočni citometer loči od ostalih, pa tudi med seboj. Tudi tukaj korak selekcije izvajamo večkrat, saj celice z domnevno izraženimi nanotelesci še enkrat namnožimo, še enkrat zmešamo z GFP in HSA proteinom ter ločujemo z metodo FACS. Sledi sekvenciranje in ponovno preverjanje s pretočno citometrijo. Podatki iz tega članka so pokazali, da sta obe tehniki nekoliko pristranski in da se predstavljena nanotelesca nekoliko razlikujejo glede na to ali so bila izražena na fagu ali na celični površini. Kaj je razlog teh razlik še ni znano, zato avtorji zagovarjajo hkratno uporabo obeh tehnik, saj bi na ta način iz določene genske knjižnice lahko izolirali karseda veliko število različnih nanotelesc, oziroma v drugih raziskavah drugih vezavnih proteinov, ki se vežejo na določen antigen.
