Tarčna mutageneza

SOMA: A single Oligonucleotide Mutagenesis and Cloning Approach

Thorsten Pfirrmann, Ashwin Lokapally, Claes Andreasson, Per Ljungdahl, Thomas Hollemann (A mutagenesis and cloning approach; June 2013; Volume 8; Issue 6)

(POVZETEK)

V imenovanem članku gre za predstavitev nove metode SOMA, katera vključuje izboljšave, glede na do sedaj poznane metode s področja tarčne manipulacije genetskega materiala

Prednost SOMA metode je predvsem uporaba DNK polimeraze, ki omogoča visoko hitrostno kontrolo branja in podaljševanja verige iz enega samega fosforiliranega mutagenega začetnega oligonukleotida, ki se prilega na plazmidno osnovo. Novo nastalo verigo, ki vsebuje mutacijo ligiramo s termostabilno Taq ligazo, ter jo po odstranitvi stare verige z razgradnjo transformiramo v gostitejsko celico.

Že znane tehnike za tarčno mutagenezo in njihove lastnosti:

- PCR;

o težava pri učinkovitosti reakcije,

o težave pri uporabi začetnih ologonukleotidov, kar lahko pripelje do tvorbe ne homolognih baznih parov znotraj novo nastalega kodona.

o Omeitveni faktor je temperatura tališča oligonukleotidov z mutiranim zaporedjem, ki mora biti dovolj visoka, da so obstojni pri višji temperaturi pomnoževanja.

- Uvajanje mutageneze na fagu (M13):

o Težave pri slabi izbiri matrice, neuspešni polimerazni reakciji in slabi kvaliteti oligonukleotidov (možnost kontaminacije).

- Mutageneza z degeneriranimi oligonukleotidi:

o Največja omejitev metode je dolžina oligonukleotidov.

o Oligonukleotidni prekurzoji morajo biti vedno sveži.

o Kritični parameter je sinteza 5´in 3´ konca; palindromsko mesto na 3´ koncu je nujno za skupno začetno sintezo dvovijačnice in razcepitev v glavni produkt.

- Kemično inducirana mutageneza: Prednost obdelave z izbranimi kemikalijami je, da ne poškodujejo fosfodiestrskega ogrodja.

- Kasetna mutageneza

Potek SOMA reakcije:

Reakcija poteče v termostatu, kjer sta temperatura in čas posamezne stopnje v naprej določena v naslednjih stopnjah:

· Denaturacija (1 min/ 95°C)

· Prileganje oligonukleotidnih začetnikov (1 min/55°C)

· 4min/ 65°C image Tvorba nove verihe s »Phusion High-fidelity« polimerazo

· Tvorba končnega produkta z ligacijo s Taq ligazo.

· Razkrajanje začetne predloge z DpnI encimom ter čiščenje produkta.

· Transformacija krožnega enovijačnega plazmida v E. Colli.

· Selekcija na gojišču in sekvenciranje produkta

Lastnosti ˝Phusion High-Fidelity˝DNK polimeraze omogočajo, da je metoda uporabna tudi za delo z zelo velikimi plazmidi.

SOMA aplikacije:

1. Kloniranje in vivo »GFP (Green Florescent Protein) Reporter plasmids« z uporabo SOMA tehnike.

· izbira začetnikov, ki prepoznajo Morpholino tarčno sekvenco homolognih regij v obe smeri okoli GFP začetnega kodona.

· PCR reakcija z istimi začetniki.

· Sinteza mutirane verige s Phusion polimerazo in Taq ligazo.

· Odstranjevanje enoverižne matrice plazmida z DpnI

· Transformacija v E. Colli

· Selekcija pozitivnih klonov na podlagi odsotnosti EcoRI mesta.

· Injiciranje TRIM2 in Standardnega morpholina v blastomere celic.

· Odčitavanje rezultata z vizualizacijo GEF v postopku fluorescentne mirkoskopije in vivo.

Test dokazuje, da je pTP218 plazmid v kombinaciji s SOMA metodo primeren za tvorbo GFP-reporter konstruktov, ter omogoča oceno morpholinske specifičnosti in vivo.

2. Od restrikcijskega mesta neodvisno kloniranje

· SOMA tehnika v kombinaciji z navadno PCR reakcijo.

· Primerna za od restrikcijskega mesta neodvisno celovito proteinsko fuzijo.

S to apikacijo so testirali 2 humani izoformi RMND5a/RMND5b ter njuni proteinski domeni. S fuzijo obeh proteinov na C-konec GFP proteina lahko spremljamo njuno lokalizacijo po transfekciji v HEK293 celice. Kljub močni podobnosti sta se posamezni izomeri lokaliziali na različnih mestih v celici. Za identfikacijo sekvenc, odgovornih za različno lokalizacijo so pripravili več hibridnih RMND5 fuzijskih proteinov z uporabo modificirane SOMA metode.

· Pomnoževanje N-koncev RMND5b s PCR.

· Oligonukleotidni začetniki obsegajo 25bp, ki so homologni RMND5a menjavnemu mestu.

· Fosforilacija dobljenega produkta in uporabili le tega kot »mega-primer« za postopek mutageneze s plazmid kodirajočim RMNDa kot matrico.

3. Ustvarjanje genskih knjižnic z regijsko usmerjenimi mutacijami, z uporabo tehnike SOMA

· Kombinacja EP-PCR in SOMA tehnike.

· Sinteza »mega-primerjev« in uporaba teh za naključno mutagenezo daljših regij.

Takšni pristopi bi bili dobrodošli pri odkrivanju novih encimov s spremenjeno aktivnostjo, specifičnostjo ali stabinostjo.

Materiali:

- Oligonukleotidi in plazmidi: pTP213 (PCR TP213fwd ter TP213rev), pRS316, pTP218 , GFP kodirajoči PCR fragmenti, pTP224 , pTP234, pAL001 .

Plazmidi pTP157, pTP158, pTP159, pTP160, pTP165, pTP167 in pTP170 vsebujejo različne s SOMA ustvarjene točkovne mutacije na poziciji 1378.

- Organizmi: Xenopus (embrionalne celice), YPD (Yeast extract peptone dextrose) medij, Celična linija HEK293 (Invitrogen), TRIM2 ter standardne morpholino injekcije (mMESSAGE, mMACHINE kit; Ambion, Austin, TX)