Transpozoni kot prenašalci odpornosti bakterij proti antibiotikom

Uvod

Pereča težava današnje družbe je razmah bakterijskih okužb. Številne bakterije so sposobne razviti odpornosti proti antibiotikom, kar otežuje učinkovito zdravljenje in preventivo pred boleznimi. Sokrivec za to so tudi transpozoni, ki prenašajo gene za odpornost proti antibiotikom med bakterijskimi vrstami.

Bakterijski transpozoni spadajo v razred DNA transpozonov. Lahko se prenašajo s plazmida na plazmid ali z DNA kromosoma na plazmid in obratno ter tako povzročijo prenos odpornosti proti antibiotikom pri bakterijah. Transpozicija lahko poteka po enem od transpozicijskih mehanizmov, to so princip kotalečega se kroga, princip izreži-prilepi in replikativni princip. Prenos transpozona iz ene bakterijske celice v drugo lahko poteče s prenosom plazmida preko konjugacijskega mostička ali preko bakteriofaga.

Pri replikativnih DNA transpozonih se zaporedje transpozona podvoji nato pa se podvojeni del prenese naprej, originalno zaporedje pa ostane na svojem mestu, pri nereplikativnem prenosu pa se zaporedje transpozona izreže iz zaporedja in prenese v plazmid ter preko konjugacije v drugo bakterijsko celico, torej prvotno zaporedje ostane brez transpozonskega dela zaporedja. Potem ko se zaporedje transpozona prenese, se na njem sintetizira mesto tarčnega podvojevanja, ki je pomembno pri vstavitvi transpozona v tarčno zaporedje.

Bakterijski transpozoni imajo značilno strukturo dveh krajših inverznih ponovitev komplementarnih zaporedij (IR), ki objemata osrednji genomski del transpozona. Ta vsebuje sekvenco, ki zapisuje za encim transpozazo. Transpozaze imajo značilno katalitično mesto DDE (Aspartat (D) –aspartat (D) –glutamat (E) in koordiniran kovinski ion. Njihova naloga je identifikacija inverznih ponovitev, rezanje in prenos DNA.

Transpozoni se med bakterijami lahko prenašajo tudi preko bakteriofagov. Prenos transpozona in z njim genov za odpornost proti antibiotikom na ta način ima prednost za bakterijo predvsem zato, ker za prenos ni potreben direkten celični stik. Dober primer fagnega transpozona, ki prenaša odpornost, je fag Mu.

Bakterijske transpozonske elemente lahko razdelimo v 4 kategorije:

- insercijska zaporedja (IS)

- sestavljeni transpozoni

- nesestavljeni transpozoni

- Mu bakteriofag

Bakterijski transpozonski elementi

Insercijska zaporedja

Insercijska zaporedja so najmanjši genski elementi, krajši od 2500 bp, ki se prenašajo med bakterijskimi genomi in samostojno kodirajo proteine. IS načeloma ne nosijo zapisa za gensko rezistenco, lahko pa so del sestavljenih transpozonov. IS so tako majhni, da poleg IR zaporedja na začetku in koncu transpozona, ki sta potrebna za prenos, vsebuje le zapis za proteine, ki inhibirajo ali aktivirajo transpozonsko aktivnost, ter encime - transposaze, ki sodelujejo pri prenosu transpozonov. Na primer IS911 je dolg 1250 bp. Objemata ga 2 IR zaporedji dolgi 36bp, kodirajoča regija pa zapisuje gene za transpozazo OrfAB in regulatorni protein ORFa.

Sestavljeni transpozoni

Sestavljeni transpozoni so obdani z insercijskima zaporedjema, vmes pa lahko vsebujejo enega ali več genov, med katerimi so lahko tudi geni za rezistenco na antibiotike. Njihovo prenašanje med bakterijami predstavlja enega najresnejših izzivov pri zdravljenju infekcijskih bolezni. Razlike med transpozoni ne predtsvaljata le dolžina in število funkcionalnih genov, ki so lahko vključeni med insercijski zaporedji, ampak tudi fukcionalnost ali nefunkcionalnost genov za transpozazo. Načeloma bi lahko bila oba gena aktivna, a zadošča že eden. Nekateri sestavljeni transpozoni so Tn5, Tn10, Tn9, Tn6, Tn903, Tn2680, Tn1525, Tn4003, Tn4001..., med katerimi so najbolj omembe vredni Tn903, Tn9, Tn10 in Tn5. Tn5 obdajata insercijski zaporedji IS50R in IS50L (L in R označujeta levo in desno) in vključuje tri gene za odpornost proti antibiotikom, in sicer gene za odpornost proti kanamicinu (kanR), bleomicinu in streptomicinu. Tn5 z vsebujočimi kanR geni lahko najdemo v Gram negativnih bakterijah, kot so na primer Methylobacterium, Agrobacterium in Pseudomonas. Pred kratkim je bilo tudi demonstrirano, da lahko Hfq molekula (to je RNA-vezavni šaperon, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA) s kataliziranjem enega snRNP delca in mRNA prepreči prenos Tn5 pri E. coli, in sicer tako, da inhibira IS50 transpozazo. Tn10 je sorazmerno dolg, in sicer kar 9300 baznih parov. Pri njem sta insercijski zaporedji na eni in drugi strani orientirani obrnjeno, posledično je zapis za transpozazo na eni strani v smerni, na drugi pa v protismerni orientaciji. Insrecijski zaporedji, ki ga obdajata, torej IS10R in IS10L sta po dolžini sicer enaki, nista pa po zaporedju identični. Med njima je 6500 baznih parov, med katere je vključen le en funkcionalen gen in to je gen za odpornost proti tetraciklinu, dolžine malo pod 1000 baznih parov. Zaradi različne orientacije gena za transpozazo lahko tudi govorimo o obrnjenih insercijskih zaporedjih, oziroma insercijskih elemntih. Tn10, ki vsebuje gene proti tetraciklinu lahko najdemo v bakterijah Proteusu, Pseudomonasu in Salmonelli. Pri Tn9 imaš levo in desno insercijsko zaporedje v isti orientaciji, torej gre za ponovljeni modul IS, na levi imaš IS1, na desni pa enak IS modul. Kot marker imaš pri njem gen za odpornost proti antibiotiku kloramfenikolu. IS1 je bil tudi identificiran kot eno prvih in tudi najmanjših insercijskih zaporedij v bakterijah (z dolžino manj kot 770 baznih parov). Tn6 je nosilec kanR gena, ima dolžino približno 5 kbp in je obdan z IS26. Za IS26 je znano, da se med bakterijskimi plazmidi njegova frekvenca vse bolj povečuje in povzroča prenašanje sestavljenih Tns (še posebej Tn6). Tn1 ima blaTEM rezistenčne gene na ampicilin in ga lahko najdemo na PR1, PR4, R8 in R68 plazmidih. Ta transpozon ima prav tako IS26 insercijsko zaporedje. Tn1 vsebuje tudi colZ gen, ki je znan kot proizvajalec eksotoksina. Tn903 je še en primer modula z obrnjeno orientacijo, tako kot Tn5 in Tn10, razlika med njimi je le v funkcionalnosti in nefunkcionalnosti obrnjenih ponovitev. Pri Tn903 imaš v obeh končnih modulih čisto funkcionalne zapise za transpozazo, medtem ko je pri Tn5 in Tn10 le desni zapis fukcionalen. Insrecijski zaporedji sta pri njem dolžine okrog 1000 baznih parov. Transpozon ima veliko številko napram ostalim predstavljenim, kar lahko nakazuje na to, da so ga sorazmerno pozno odkrili. Bil je izoliran iz bakterije Salmonella typhimurium in ima neomicin-kanamicin fosfotransferazo, saj kodira aminoglikozid 3′-fosfotransferazo I, ki fosforilira zgoraj omenjena kanamicin in neomicin. Identificirali so ga kot enega ključnih predelov plazmida R6.

Nesestavljeni transpozoni

Nesestavljeni transpozoni nimajo insercijskih zaporedij na obeh koncih, ampak samo inverzni zaporedji na vsaki strani in so nosilci genov za odpornost proti antibiotikom ter gena tnpA za transpozazo in gena tnpR za resolvazo. Največ nesestavljenih transpozonov pripada Tn3 družini, nekatere druge družine so še Tn2, Tn7, Tn21 … V 60. In 70. letih prejšnjega stoletja so ljudje vživali velike količine aminopenicilina, kar je povečalo število bakterij s transpozoni z odpornostjo na te antibiotike, hkrati pa se je povečal pomen transpozicij takih transpozonov. Posledično so postali tudi bistveno bolj razširjeni. Med transpozone z genom za β-laktamazo med drugim spadajo družine Tn1, Tn2 in Tn3. Tn3 vsebuje tudi gen za rezistenco na ampicillin in ga najdemo tako v Gram negativnih kot v Gram pozitivnih bakterijah. Zgolj pri Gram negativnih bakterijah vsebuje še gen za β-laktamazo. Transpozoni iz družin Tn1 in Tn2 imajo približno 99 % identičnost v primerjavi s transpozoni iz družine Tn3 v večjem delu zaporedja, identičnost je manjša le na krajših zaporedjih na obeh straneh regije res. Obe družini pa prav tako nosita gen za β-laktamazo. Najbolj razširjeni med temi tremi družinami so transpozoni iz družine Tn2. Družina Tn2 se pogosto zaradi velike podobnosti označi kar s Tn3.

Tn7 je transpozon, ki lahko nosi gen za rezistenco proti trimetoprimu, streptomicinu in spektinomicinu. Poleg tega pa vsebuje še zapise za 5 proteinov (TnsA, TnsB, TnsC, TnsD in TnsE), ki sodelujejo pri transpoziciji. Zaradi velikega števila proteinov je proces transpozicije pri tem transpozonu zelo dobro reguliran. TnsA in TnsB sta podenoti transpozaze, ki prepoznata dve terminalni zaporedji Tn7, TnsC je protein, ki uporablja ATP ter z njeno hidrolizo kontrolira delovanje transpozaze, TnsD in TnsE pa pomagata pri prepoznavanje tarčnega mesta za transpozicijo Tn7. TnsD prepoznava zaporedje glmS gena, ki kodira C-konec glukozamin-6-fosfat sintaze. Bolj natančno prepozna mesto attTn7, ki se nahaja na transkripcijskem terminatorju za gen glmS. Pri transpoziciji na to mesto ni negativnih posledic na gostitelja. TnsE ne prepoznava specifičnih zaporedij na DNA. Preferenčno pa usmerja transpozicijo na mobilne plazmide. TnsE torej skrbi za prenos transpozona v novega gostitelja, TnsD pa zagotovi transpozicijo v gostitelju. Transpozaza Tn7 lahko interagira s procesivnostnimi faktorji v procesu replikacije. Ta interakcija sicer omeji proliferacijo transpozona, vendar to favorizira izbiro tarčnega mesta, saj do transpozicije ne pride, dokler transpozaza ne najde primerne tarče.

Tn21 vsebuje gene za odpornost proti živemu srebru, cefalosporinom in sulfonamidom, Tn501 vsebuje gene za bakterijsko rezistenco proti težkim kovinam. Obstajajo pa še mnogi drugi nesestavljeni transpozoni z različnimi geni za odpornost proti za bakterije škodljivim snovem, kot so antibiotiki.

Mu-bakteriofag

Mu-bakteriofag je vrsta fagov z genetskim materialom, ki se obnaša kot insercijska sekvenca, ki je sposobna transpozicije. Tako kot transpozicijski elementi lahko prenaša gen za rezistenco proti antibiotikom. Obdan je z attR in attL inverznima zaporedjema, ki ju prepozna transpozaza. Ta bakteriofag prenese gene v dveh ciklih, in sicer litičnem in lizogenem ciklu. Pri replikaciji in prenosu genov so pomembni proteini MuA (za rekombinacijo z bakterijskim genomom), MuB (da najde mesto integracije v genomu), IHF (za integracijo v kromosom) in HU (histonu podobni protein, ki se veže na DNA). Prenos genov poteče v litičnem ciklu, ko se nekateri geni bakterijske rezistence prenesejo na fag Mu, ki lahko nato okuži druge bakterije in tako prenese rezistenčni gen.

Viri

• 1.Babakhani, S. & Oloomi, M. Transposons: the agents of antibiotic resistance in bacteria. J Basic Microbiol 58, 905–917 (2018).

• 2.Razavi, M., Kristiansson, E., Flach, C.-F. & Larsson, D. G. J. The Association between Insertion Sequences and Antibiotic Resistance Genes. mSphere 5, e00418-20 (2020).

• 3.Baquero, F., Tedim, A. P. & Coque, T. M. Antibiotic resistance shaping multi-level population biology of bacteria. Front. Microbiol. 4, (2013).

• 4.Haniford DB, Ellis MJ. Transposons Tn10 and Tn5. Microbiol Spectr 2015;3:MDNA3-0002-2014.