Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za namen de novo proizvodnje dihidrohalkonov z znanimi antioksidantnimi in antidiabetičnimi učinki ter s sladkim okusom.
Dihidrohalkoni (DHC) so sekundarni rastlinski metaboliti, ki vsebujejo molekule, ki so zanimive za uporabo kot antioksidanti, antidiabetiki in sladila. Nahajajo se v številnih rastlinah, med drugim tudi v grozdju, malinah in jabolkih. Dihidrohalkoni imajo skelet iz 1,3-difenilpropan-1-on-a. Poznamo več kot 200 strukturno različnih dihidrohalkonov. Funkcionalna vloga teh spojin v rastlinah je zaenkrat slabo poznana, veliko pa je zanimanja za njihove učinke za zdravje ljudi.
Uporaba DHC-jev
Florizin je hipoglikemično sredstvo in deluje tako, da zavira glukozna transporterja SGLT1 in SGLT2, ki sodelujeta pri absorpciji glukoze v črevesju in reabsorpciji v ledvicah. Uporabili so ga za osnovo pri načrtovanju več kot desetih antidiabetičnih zdravil, trije od teh so bili odobreni s strani FDA in EMA. Aspalatin in notofagin imata močne antioksidantne učinke in se nahajata v rooibos-u (Aspalathus linearis). Naringin dihidrohalkon (NDC) in neohesperidin dihidrohalkon (NHDC) sta sladili z 1-kratno in 20-kratno sladkostjo saharina, ki ju lahko kemično sintetiziramo iz citrusnih flavanonov. Neohesperidin dihidrohalkon je v Evropi odobren za uporabo kot aditiv v prehrani (E959).
Metode dela
Za subkloniranje genov so uporabili celice E. coli. Kodirajoča zaporedja za izbrane encime so pomnožili s PCR in jih klonirali v ekspresijske kasete plazmidov. Te so z in vivo homologno rekombinacijo (metoda DNA »assembler«) združili v multiekspresijske plazmide. Vsi eksperimenti (izražanje biosinteznih poti) so potekali v S. Cerevisiae.
Testiranje reduktaz dvojnih vezi (DBR) za proizvodnjo floretina v kvasovkah
Pomemben korak pri proizvodnji DHC-jev je redukcija α,β-dvojne vezi v p-kumaroil-CoA. Raziskovalci so testirali reduktaze iz jabolk, ki so bile predhodno omenjene v različnih študijah, vendar z nobenim od teh encimov niso dosegli uspešne aktivnosti v kvasovkah. Namesto tega so izkoristili stransko aktivnost nativne dolgoverižne enoil-CoA reduktaze ScTsc13 iz kvasovke. S čezmernim izražanjem omenjenega encima so uspešno reducirali dvojno vez v p-kumaroil-CoA in dobili floretin. Nastanek naringenina (obsežnega stranskega produkta osnovne poti) pa so znatno zmanjšali z uporabo visoko specifične halkon-sintaze (CHS) iz ječmena.
Uporaba ScTsc13 za proizvajanje pinocembrin DHC-ja
Večina naravno prisotnih DHC-jev izvira iz floretina, nekatere rastline (Uvaria angolensis, Mitrella kentia) kopičijo tudi DHC-je, ki nimajo 4-hidroksi skupine. To pomeni, da najverjetneje izhajajo iz pinocembrin DHC-ja in nastanejo s pomočjo encima CHS iz dihidrokiscinamoil-CoA in treh enot malonil-CoA. Ustvarili so seva PIN1 in PIN2, ki sta vsebovala pot za pinocembrin (AtPAL2, At4CL2 in HaCHS) z ali brez prekomerno izraženega ScTSC13. Sev PIN1 z nativnim izražanjem ScTSC13, je proizvedel 1.47 ± 0.07 mg/l pinocembrin DHC-ja poleg 11.6 ± 0.3 mg/l pinocembrina. Prekomerno izražanje ScTSC13 v sevu PIN2, je povečalo proizvajanje pinocembrin DHC-ja na 0.43 ± 0.06 mg/l. To dokazuje, da je tudi cinamoil-CoA substrat ScTsc13.
Proizvodnja derivatov floretina
V študiji so opisali tudi proizvodnjo monoglikoziliranih DHC-jev (florezina in notofagina) in NDC-jev z uporabo poznanih od UDP odvisnih glikoziltransferaz (UGT) ter proizvodnjo 3-hidroksifloretina. Proizvodnja različnih derivatov floretina je bila uspešna z dodatkom encimov z znano aktivnostjo za DHC-je ali z izkoriščanjem substratov encimov, ki so naravno prisotni pri biosintezi flavonoidov ali halkonov.
Zaključek
V študiji poročajo o de novo proizvodnji številnih DHC-jev v mikrobnem gostitelju, z izražanjem celotnih biosinteznih poti, ki vsebujejo 4-9 genov. Raziskovalcem je uspela proizvodnja antioksidanta notofagina, antidiabetika florizina, sladke molekule naringin dihidrohalkona in 3-hidroksifloretina. V študiji je bila heterologna proizvodnja DHC-jev še kar obsežna, vendar pa bi bilo za ekonomsko izvedljiv industrijski proces potrebno precejšnje zvišanje proizvodnje omenjenih spojin.
Viri
M.Eichenberger, B.J. Lehka, C. Folly, D. Fischer, S. Martens, E. Simón, M. Naesby: Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for de novo production of dihydrochalcones with known antioxidant, antidiabetic, and sweet tasting properties. Metabolic Engineering. 2017, 39, 80–89.
