View source for Orodja in načela za inženiring genskih vezij mikroorganizmov

=='''UVOD'''==
Sintezni biologi skozi racionalno načrtovanje in napredno inženirstvo stremijo k ustvarjanju novih genskih vezij, ki bi imela široko uporabnost. Imajoči v mislih kompleksnost procesiranja signalov, ki se pojavljajo v naravnih bioloških sistemih, inženirski mikroorganizmi imajo potencial za opravljanje številnih koristnih nalog, ki zahtevajo sofisticirano računalniško vodenje in kontrolo.   
Ta članek predstavlja pregled vsestranskih komponent in orodij, ki so trenutno dostopna za inženiring genskih vezij v mikroorganizmih, vključno z nedavno razvitimi RNA orodji, ki vsebujejo zelo široko dinamično območje in se lahko programirajo. Seznanili se bomo z oblikovalnimi načeli, ki omogočajo robustno in razširljivo delovanje vezij, prav tako pa bomo pogledali nekatere efikasne strategije za hitro identifikacijo in popravljanje napak ter fino nastavljanje lastnosti vezij.

=='''Orodja za RNA inženiring'''==
Transkripcija je verjetno najpomembnejša kontrolna točka v genskih vezjih, ker zagotavlja celovito regulacijo izražanja vseh komponent. Kontrolni elementi se lažje sestavljajo na nivoju DNA, s čimer se izognemo težavam, ki lahko nastanejo kot posledica sekundarnih struktur molekul mRNA. 

==='''Vezava RNA'''===
Nukleotidno zaporedje promotorja, na katero se veže RNA-pomieraza (RNAP), je temeljna determinanta hitrosti transkripcije. Do vezave pride preko σ70- tipa faktorjev na -10 in -35 mesto od začetka transkripcije, kar hkrati določa samo specifičnost iniciacijskega mesta, medtem ko se C-končna domena α podenote preferenčno veže na kratko zaporedje ponovitev A in T baz, 30 mest navzgor od -35 mesta (UP element) in s tem določa jakost promotorja. Raziskave vpliva UP elementov na jakost promotorja so pokazale, da se vpliv le-teh na jakost promotorja z višanjem koncentracije RNAP zmanjšuje in obratno. Zaporedje navzdol od začetka transkripcije prav tako lahko vpliva na potek transkripcije same, vendar se z uporabo standardnih 5'-neprevajajočih se regij (UTR), temu vplivu lahko izognemo. Knjižnice promotorjev s širokim razponom jakosti predstavljajo dragoceno zbirko, ki jih biološki inženirji s pridom izkoriščajo in jo bodo izkoriščali, dokler se ne pojavijo popolni napovedni modeli.

==='''Proteinski regulatorji transkripcije'''===

'''''Aktivatorji'''''

Klasični aktivatorji, ki jih uporabljamo pri oblikovanj genskih vezij, kot je LuxR, delujejo na ta način, da stabilizirajo vezavo RNAP na promotor. Rhodius in kolegi so izkoristili ekstracitoplazmične funkcijske σ faktorje (ECFs) za izgradnjo največje knjižnice ortogonalnih transkripcijskih regulatorjev za E. coli, pri čemer so našli 20 parov ECFs in sorodnih promotorjev, ki imajo zelo nizko navzkrižno reaktivnost. Ti proteini se vežejo na regije -35 in -10 in s tem določajo specifičnost vezave RNAP na določen promotor. Ostali transkripcijski aktivatorji, ki so koristni za uporabo v E.coli vključujejo tri šaperon-aktivatorske pare (ki se lahko izkoristijo za AND logiko), fagne transkripcijske aktivatorje ter HrpRS bakterijske ojačevalne proteine.

'''''Represorji'''''

Represorji najpogosteje delujejo na ta način, da RNAP onemogočijo dostop do promotorja. Stanton in sodelavci so ustvarili knjižnico homologov TetR in njihovih naravnih operatorjev, ki vsebuje 16 ortogonalnih variant. Obstaja tudi manjša knjižnica variant represorja LacI. Zelo zanimivo družino represorskih proteinov predstavljajo transkripcijskim aktivatorjem podobni efektorji (TALEs). TALE represorji se lažje modelirajo v primerjavi s proteini s cinkovimi prsti in se lahko uporabljajo za kontrolo več kompleksnih genov. Pokazali so da z njimi lahko dosežemo do 100-kratno znižanje ravni izražanja v E.coli.

==='''RNA kontrola transkripcije'''===
Lep primer kontrole transkripcije z RNA predstavlja pT181 transkripcijski atenuacijski sistem, katerega različice so razvite za kontrolo genskih vezij v E.coli. Naravni pT181 mehanizem koristi 5'- UTR zanko, ki normalno omogoča elongacijo transkripcije; interakcija med zanko na taRNA z 5'-UTR zanko na mRNA promovira nastanek steblo-zanka strukture, ki povzroči terminacijo transkripcije. 
Majhne RNA molekule, ki aktivirajo transkripcijo (STARs), so dizajnirane da porušijo strukturo terminatorja, bodisi preko vezave na zanko, ki se nahaja v zaporedju navzgor ali preko direktne vezave na terminator. Ta pozitivna regulacija sistema pT181 omogoča zelo visoko dinamično območje (94-kratno), v primerjavi s klasičnimi represorji in je prav tako uporabna za izgradnjo večplastnih logičnih vrat.

=='''Orodja za inženiring izražanja proteinov'''==

==='''Ortogonalni ribosomi'''===
Vezava ribosoma na molekulo mRNA je posledica prepoznavanja in baznega parjenja med RBS in anti-Shine-Dalgarno zaporedjem, ki je zapisano v 16S rRNA. To lastnost so izkoristili za ustvarjanje treh dodatnih ortogonalnih ribosomov z modificirano 16S rRNA, ki inicira traslacijo samo na mRNA s sorodnim RBS. Transkripcija obeh ortogonalnih rRNA ter mRNA je potrebna za izražanje tarčnega gena, s čimer dobimo AND logična vrata. 

==='''RNA stikala'''===
Z RNA stikali lahko vplivamo na translacijo preko od liganda odvisne spremembe konformacije 5'-UTR  regije mRNA, s čemer otežimo dostop do RBS. Sharma in sodelavci so pokazali da RNA stikala lahko kombiniramo za izgradnjo AND in NAND logičnih vrat. Od temperature odvisni RNA regulatorji prav tako delujejo preko kontrole dostopnosti RBS za vezavo ribosoma. 

==='''taRNA kontrola translacije'''===

'''''taRNA-represija'''''
Mehanizem inhibicije translacije z majhnimi RNA molekulami (sRNAs) je konceptualno preprost, zaradi česar je tudi izvajanje same metode relativno enostavno: sRNA vsebuje zaporedje komplementarno tarčni mRNA in se veže na RBS ali na zaporedje navzdol ter na ta način prepreči vezavo ribosoma. Vezavna energija sRNA-mRNA je korelirana z jakostjo inhibicije.

'''''taRNA-aktivacija'''''
Green in sodelavci so pred kratkim opisali razvoj RNA-stikal tipa »toehold«, oziroma zank, ki onemogočajo normalen potek translacije. Aktivacija translacije poteka preko vezave »sprožilne« RNA, ki se veže na zaporedje navzgor od zanke in ji spremeni strukturo. Najbolj učinkovita tovrstna stikala zajemajo kar 600-kratno dinamično območje, kar je za red velikosti bolje od ostalih taRNA kontrolnih mehanizmov.

=='''Modularnost in ortogonalnost'''==
Modularnost predstavlja kvaliteto konzistentnosti funkcije v številnih pogojih in kontekstih in je en izmed temeljnih pogojev za napovedni dizajn genskih vezij. Ortogonalnost zagotavlja da elementi in moduli ne bodo izražali neželene interakcije z drugimi elementi v inženirskih bioloških sistemih, prav tako pa tudi ne z genskim ozadjem gostitelja. Zato sta ti dve lastnosti nepogrešljivi pri načrtovanju kompleksnih genskih vezij.

==='''Fizična kompozicija'''===
Sinteznobiološki elementi so lahko občutljivi na spremembe v robnih zaporedjih, ki jih obkrožajo. Iz analize 12,563 kombinacij promotorjev in RBS, Kosuri in sodelavci so odkrili, da se približno 17 % vseh variacij v ravni izražanja proteinov ne more napovedati iz jakosti promotorjev, oziroma RBS. Mutalik in sodelavci so ugotovili, da spoji promotor: UTR in UTR: tarčni gen (GOI) v znatni meri vplivajo na variabilnost v izražanju genov in so naredili operacijsko enoto izražanja (EOU). Uporaba EOU omogoča veliko konzistentnost v nivojih izražanja tarčnih genov, ko menjavamo različne promotorje in RBS, kar ima veliko napovedno moč pri oblikovanju novih genskih vezij in finem usklajevanju ravni izražanja proteinov.

==='''Vpliv gostitelja'''===
Cardinale in sodelavci so iz analize velikega števila sevov E.coli ugotovili, da sta dostopnost ribosomov in hitrost rasti ključne determinante za učinkovitost genskih vezij. Ugotovili so tudi, da specifične delecije gostiteljskih genov imajo lahko veliki vpliv na genska vezja. Te mutacije posredno vplivajo na učinkovitost vezja preko sprememb v fluksu ogljikovega in dušikovega metabolizma. Komplementarni pristop spreminjanja gostiteljskega genetskega (in metabolnega) ozadja preko dodajanja določenih genov, lahko pozitivno vpliva na učinkovitost vezja.

==='''Robustnost in genetska stabilnost'''===
Robustna genska vezja vzdržujejo svojo učinkovitost skozi čas in v različnih pogojih – prilagajajo se spremembam, kot je različna hitrost rasti ali dostopnost transkripcijskih faktorjev, in pogosto imajo zelo visoko razmerje signal-šum. Genska vezja, ki so prilagodljiva in ne predstavljajo preveliko breme za gostitelja, sta tudi bolj robustna s stališča genetske stabilnosti. Zaželeno je, da so vezja ortogonalna, in da ne interreagirajo z gostiteljem, s čimer se tudi povečuje robustnost. V primeru, da se medsebojni interakciji ne moremo izogniti, gensko vezje lahko preoblikujemo tako, da dinamično uravnava svojo ekspresijo kot odgovor na povečani stres, ki ga povzroča gostitelju.

=='''Popravljanje napak in fina nastavitev genskih vezij'''==
Brez popolnoma napovednih zmogljivosti, načrtovanje genskih vezij neizogibno zahteva stopnje popravljanja napak ter fine nastavitve. Razlogi za neuspeh se najprej morajo identificirati, da bi vezje lahko normalno funkcioniralo znotraj želenih parametrov.

==='''Nastavljivi elementi v genskih vezjih'''===
Enkrat, ko se ugotovi razlog za neuspeh, se morajo narediti spremembe v vezju. Komponente je mogoče treba zamenjati, zaradi toksičnih učinkov njihovega izražanja, ali mogoče zaradi neustreznega dinamičnega območja njihovega izhodnega signala. Če je komponenta del velike ortogonalne zbirke, jo lahko zamenjamo z bolj ustrezno varianto. Ojačevalce signala lahko uporabimo v primeru, da hočemo popraviti signal komponente navzgor. Drugače obnašanje posameznih komponent lahko popravimo s spremembo jakosti promotorjev ali RBS, stopnje razgradnje genskih produktov ali števila posameznih komponent.

==='''Strategije za odpravljanje napak'''===
Ena izmed najbolj uporabljanih strategij za fino nastavljanje delovanja genskih vezij, je uporaba BioBrick standardov. Medtem, ko je uvajanje mutacij v komponente tekom začetnega sestavljanja enostavno, enkrat, ko so deli povezani v večje module, nadaljnje spreminjanje posameznih komponent ni več možno. Za ponovno uvajanje variacij se moramo vrniti na korak, ko smo dodajali posamezne komponente ali uporabimo nekatero izmed metod, ki temeljijo na PCR. SLIC, Gibsonovo sestavljanje, CPEC in SLiCE so metode zasnovane na PCR, ki predstavljajo dobro alternativo sestavljanju preko linkerjev, ker se z njimi izognemo nastanku »brazgotin«, ki lahko vplivajo na funkcionalnost vezja. 
MAGE je zelo močno orodje za uvajanje variacij po predhodnem sestavljanju komponent. Metoda temelji na uporabi različnih ssDNA oligonukleotidov, s katerimi preko λ-Red rekombinaze uvedemo mutacije na ustreznih mestih. 

=='''Zaključek'''==
Po skoraj 15 letih pospešenega napredovanja, sintezna biologija je prišla do stopnje, kjer je na razpolago veliko orodij in osnovnih gradnikov za inženiring genskih vezij. Veliki napredek je ostvarjen tudi na polju ortogonalnosti in modularnosti gradnikov, kar omogoča bolj predvidljivo in robustno načrtovanje kompleksnih genskih vezij. Gradniki, ki temeljijo na RNA, bodo najverjetneje imeli glavno vlogo pri nadaljnji sofistikaciji genskih vezij, zaradi svoje enostavne programabilnosti in ker njihovi termodinamski modeli zelo dobro napovejo obnašanje v genskih vezjih. 
Čeprav zelo dinamično in nedefinirano okolje gostitelja pogosto ovira normalno delovanje genskih vezij, strategije, ki temeljijo na uporabi izoliranih delov in racionalnem iskanju optimalnih parametrov bodo zmanjšale čas potreben za izgradnjo kompleksnih vezij. Variacije, ki so posledica interakcij z gostiteljskim metabolizmom, bi se še lahko znižale z uporabo sevov z reduciranimi genomi.