View source for Popolna biosinteza hondroitin sulfata v E. coli

==Uvod==
Glikozaminoglikani (GAG) so dolge verige nerazvejanih polisaharidov, ki so del zunajceličnega matriksa. Sestavljeni so iz ponavljajočih se disaharidnih enot povezanih z glikozidno vezjo [1]. So pomembne biološke molekule, ki se pridobivajo z izolacijo iz živalskih tkiv. Eden najpogostejših GAG-ov pri človeku, hondroitin sulfat (CS), se v medicini uporablja za zdravljenje osteoartritisa. Zaradi variabilnosti mesta sulfatacije in velikosti polimerov, možnosti kontaminacij ter netrajnosti pridobivanja GAG-ov iz živalskih virov, so se avtorji članka odločili za mikrobno proizvodnjo CS v ''E. coli'' [1, 2].

==Proizvodnji sistem==
Biosinteza CS v ''E.coli'' zahteva 3 komponente: prekurzor hondroitin, donor sulfatne skupine 3′-fosfoadenozin-5′-fosfosulfat (PAPS) in hondroitin sulfotransferazo. Od 11 metabolnih korakov za sintezo hondroitina, je 9 že prisotnih v klasičnih sevih ''E.coli''. Encima za preostala 2 koraka, UDP-N-acetilglukozamin-/UDP-glukozamin-4-epimeraza in hondroitin sintaza, vsebuje sev ''E.coli'' K4, zato so ga izbrali za proizvodnjo CS. Sev K4 proizvaja fruktoziliran hondroitin kot sestavni del polisaharidne kapsule [2]. Fruktozilacija hondroitina je pri sintezi hondroitin sulfata nezaželjena, zato so s homologno rekombinacijo Lambda Red izbrisali zapis za fruktozil transferazo (Δ''kfoE'') [2, 3]. V sev K4 so na mesto ''LacZ'' vstavili še zapis za T7 RNA polimerazo, da so dobili E. coli Δ''kfoE'' (DE3) [2]. Ključni encim, ki katalizira sulfatacijo hondroitina, hondroitin sulfotransferaza, je živalskega izvora in se nahaja Golgijevem aparatu (GA). Zapis za hondroitin-4-O-sulfotransferazo (Sw) so v celice ''E.coli'' K4 Δ''kfoE'' (DE3) vstavili s plazmidom pETM6-Sw [2].

==Rezultati in optimizacija proizvodnje==
Donor sulfatne skupine PAPS, ki je potreben za sulfatacijo hondroitina, nastaja v biosintezni poti cisteina/metionina, ki poteka v skoraj vseh celicah. Kljub temu, v sevu ''E. coli'' Δ''kfoE'' (DE3) pETM6- Sw ni prišlo do sinteze CS. Ugotovili so, da encim PAPS reduktaza (cysH), zmanjšuje koncentracijo PAPS-a v celici in s sulfotransferazo tekmuje za substrat. S pomočjo homologne rekombinacije Lambda Red so uvedli delecijo zapisa za PAPS reduktazo Δ''cysH''. V ''E. coli'' Δ''kfoE'' Δ''cysH'' (DE3) pETM6-Sw so dosegli 19 % sulfatacijo hondroitina, kar je manj kot pri CS izoliranem iz živalskih tkiv. Nasprotno pa je dodatno izražanje genov, ki sodelujejo pri nastanku PAPS, ''cysDN'', ''cysC'' in ''cysQ'', močno zmanjšalo sulfatacijo hondroitina [2].
V nadaljevanju so poskusili povečati aktivnost sulfotransferaze. Ker struktura encima ni znana, so naredili homologni model strukture sulfotransferaze Sw na osnovi predhodno razrešene strukture sulfotransferazne domene olefin sintaze iz ''Synechococcus''. Uporabili so spletni program PROSS, ki je predlagal tri variante Sw z večimi mutacijami v zaporedju: SM1, SM2, in SM4. Zapise za variante sulfotransferaze  so vstavili v celice ''E. coli'' Δ''kfoE'' Δ''cysH'' (DE3), da bi potrdili vpliv mutacij v in vivo proizvodnjem sistemu. Z izražanjem SM1 in SM4 so dobili podoben delež sulfatacije kot pri Sw, medtem ko so pri SM2 dobili kar 3× večji delež sulfatacije [2].

Pogoji rasti in indukcije imajo pomemben vpliv na biosintezo mikrobnih produktov. Celice K4 Δ''kfoE'' Δ''cysH'' (DE3) pETM6-Sw so gojili in inducirali z IPTG pri različnih fazah rasti. Primerjali so indukcijo pri različnih OD600 (0,6 in 1), različne koncentracije IPTG (0,5 in 1 mM) ter temperature izražanja (37, 20, 16 °C). Največji delež sulfatacije so dobili pri OD600 1,  z 0,5 ali 1 mM IPTG, izražanje 12 h  na 20 °C in pri OD600 0,6, z 1 mM IPTG in izražanje 24 h na 16 °C. Z optimizacijo indukcije so dosegli izboljšanje sulfatacije CS iz 19 na 23 % [2].

Divji tip ''E. coli'' K4 izvaža fruktoziliran hondroitin preko membranskega ABC transporterja. V predhodnih raziskavah so ugotovili, da se večina nesulfatiranega hondroitina prenese v medij [2, 4]. Avtorji tega članka, so ugotovili, da se CS ne nahaja v mediju, temveč v celoti ostane v znotrajceličnem prostoru. Čeprav so v prejšnih stopnjah optimizacije izboljšali znotrajcelično sulfatacijo, se večina hondroitina prenese iz celice v nesulfatirani obliki. Izvoz nesulfatiranega hondroitina in sulfatacija hondroitina sta dva tekmovalna procesa. Da bi zmanjšali vpliv transportne aktivnosti na znotrajcelično sulfatacijo, so s pomočjo CRISPRi naredili represijo genov transporterja. ABC transporter sestavljajo 4 proteini, KpsT, KpsM, KpsD in KpsE [2]. Naredili so 5 distančnikov, ki ciljajo ''kpsT'' in ''kpsM'' (dT1, dT2, dT3, dM1 in dM2) in jih sklonirali v CRISPRi plazmid pdCas9, s katerim so nato transforimirali celice ''E. coli'' K4 Δ''kfoE'' Δ''cysH'' (DE3) pETM6-Sw [2, 5]. Najboljše se je obnesla varianta s pdCas9-dM1, saj se je izvoz zmanjšal kar za 60 %. Sulfatacija hondroitina pri tem sevu se je povečala 3× na 55 % [2].

==Zaključek==

V eksperimentu, opisanem  v članku, so v celice ''E. coli'' K4 uspešno vključili zapis za sulfotransferazo in uvedli potrebne delecije za biosintezo hondroitin sulfata. Z dodatno optimizacijo so dosegli končno 55 % sulfatacijo hondroitina, kar je blizu 70 % sulfataciji  pri živalih. Gre za bolj trajnostno proizvodnjo, katere glavna prednost je, da za razliko od živalskega CS, mikrobni CS poleg 4-O- ne vsebuje še 6-O-sulfatiranega izomera CS.

==Literatura==

# Köwitsch, A., Zhou G., Groth T.: Medical application of glycosaminoglycans: a review. J Tissue Eng Regen Med. 2017, 12.  
# Badri, A., ''et al''.: Complete biosynthesis of a sulfated chondroitin in Escherichia coli. Nature communications. 2021, 12.
# Datsenko, A. K., Wanner, L. B.: One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. PNAS. 2000, 12.
# He, W (2017). Metabolic Engineering and Applied Enzymology for the Preparation of Nutraceutical/Pharmaceutical Chondroitin Sulfate. PhD thesis, Rensselaer Polytechnic Insitute.
# Bikard, D., ''et al''.: Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system. Nucleic Acids Research. 2013, 15.