View source for KrCRISPR: enostavna in učinkovita strategija generiranja pogojnega izbijanja esencialnih genov

Ključni pristop določanja celične funkcije genov je tehnologija izbijanja genov, ki pa je za esencialne gene omejena zaradi letalnosti. Za njihovo preučevanje se uporablja pogojno ali inducibilno izbijanje genov. Od običajnega izbijanja se razlikuje v tem, da je časovno in/ali tkivno specifično. Klasični pristopi pogojnega izbijanja ali inaktivacije zajemajo Cre/loxP in Tet-Off sisteme. Izražanje CRISPR/Cas9 sistema z episomskega vektorja tako predstavlja alternativo pogojnega izbijanja esencialnih genov <ref name="prvi"> Wang, B. et al.  (2019):  krCRISPR: an easy and efficient strategy for generating conditional knockout of essential genes in cells. Journal of Biological Engineering, 13(1). doi:10.1186/s13036-019-0150-y </ref> <ref name="drugi"> Lewandoski, M. (2001):Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics, 2(10), 743–755. doi:10.1038/35093537 </ref>.

== krCRISPR tehnologija ==

Tehnologijo pogojnega izbijanja na osnovi CRISPR/Cas9 sistema, imenujemo '''krCRISPR (ang. »knockout-rescue CRISPR)'''. Temelji na kotransfekciji dveh episomskih vektorjev, ki omogočajo dolgotrajno urejanje genoma, selekcijo in eksogeno,inducibilno izražanje izbitih genov. '''Plazmid za izbijanje (KO ali ang. knockout plasmid)''' nosi zapis za SpCas9 endonukleazo, vodilno RNA (gRNA) za uvajanje premika bralnega okvirja in zapis za tetraciklinski transaktivator tTA, ki omogoča regulirano izražane genov iz '''reševalnega plazmida (RP ali ang. rescue plasmid)'''. Slednji nosi zapis za izbiti protein rezistenco proti puromicinu ter zapis za zeleni fluorescenčni protein (GFP). Gena sta pod kontrolo tetraciklinskega indukcijskega sistema (pTRE) in ločena s T2A peptidom. 
Za živost celic je potrebno vzdrževanje obeh plazmidov. To zagotavlja EBNA1 protein, ki s svojo vezavo na mesto začetka podvojevanja iz Epstein-Barr virusa (oriP) pozitivno regulira podvojevanje plazmida.
Episomalno ohranjanje RP je tako odvisno od izražanja EBNA1 s KO plazmida <ref name="prvi"/>. 

== Preverjanje sistema ==

Odvisnost plazmidov za ohranjanje v celičnih linijah (HEK293T, A375, H9, Hela)  so preverjali s posamično transfekcijo plazmidov in kotransfekcijo obeh. Kot pričakovano, je živost celic bilo mogoče zaznati samo pri kotransfeciranih celičnih linijah. 
Analiza polimorfizma dolžin restrikcijskih fragmentov (RFLP) je pokazala ohranjanje obeh plazmidov tudi po 10 dneh, njuna kvantifikacija pa kaže na preferenčno podvojevanje KO plazmida, kar razlagajo z intaktnim zapisom za oriP/EBNA1. 
Izražanje z RP so preko merjenja GFP signala, zaznali in kvantificirali, s pomočjo pretočne citometrije. Pod puromicinsko selekcijo se je izražanje povečalo, po dodatku doksiciklina pa zmanjšalo. 
Učinkovitost izbijanja genov so preverili z izbijanjem gena za poli-ADP-riboza polimerazni protein 1 ('''PARP1'''). Frekvenco klonov z izbitimi geni so določili s pomočjo T7E1 testa. Frekvenca se je s časom povečala. Homozigotne klone so potrdili s sekvenciranjem po Sangerju <ref name="prvi"/>.

== Izbijanje esencialnih genov ==

Učinkovitost izbijanja so preverili s pogojim izbijanjem dveh znanih esencialnih genov; gen za histonsko deacetilazo 3 ('''HDAC3''')  in gen za DNA metil transferzao 1 ('''DNMT1'''). Da ne bi prišlo do prepoznave protovmesnika in protovmesniku bližnjega motiva (PAM) v eksogenem zapisu gena na RP, so vanj vnesli 5-7 tihih točkovnih mutacij. 
Podobno kot za PARP1, so tudi za HDAC3 in DNMT1 preverili frekvenco izbijanja ter tudi zanje ugotovili povečano frekvenco po času. 
Z dodatkom doksiciklina v gojišče so nato inhibirali izražanje eksogenih proteinov, stopnji izražanja pa so sledili z merjenem GFP signala in s kvantifikacijo mRNA s PCR v realnem času (Q-PCR). Za določanje izražanja DNTM1 so dodatno izvedli še prenos western, z metodo LUMA (luminumetrični metilacijski test) pa določili stopnjo metilacije.
Tako so za klone z eksogeno izraženo DNTM1 ter za divji tip določili enako stopnjo metilacije. Klon z doksiciklinom inhibiranim izražanjem pa je v primerjavi imel signifikantno znižano stopnjo metilacije <ref name="prvi"/>.

== Preučevanje točkovnih  mutacij ==
 
Za krCRISPR so predpostavili, da omogoča tudi preučevanje vpliva točkovnih mutacij. To so dokazali z zamenjavo reševalnega plazmida 1 z reševalnim plazmidom 2, ki nosil zapis za variacijo izbitega gena. Zraven slednjega še nosi zapis za rezistenco proti zeomicinu in zapis za rdeči fluorescenčni protein (RFP). 
Prej pripravljene klone z endogeno izbitim DNTM1 so prenesli v gojišče z zeomicinom, da bi prišlo do zamenjave med reševalnim plazmidom 1 in 2. Po 22 dneh so določili 17,5-29,4% GFP pozitivnih celic in 75,5-97,2% RFP pozitivnih celicah. 
V zapis za DNTM1 so uvedli 3 znane mutacije ('''Y15C, A570V in P507L'''), ki jih povezujejo s patološkimi stanji ter eno ('''H79R'''), katero ne povezujejo s patološkimi stanji. Stopnja metilacije se je v primeru Y15C, A570V in P507L zmanjšala za približno 10%, mutacija H79R ni pokazala spremembe v stopnji metilacije <ref name="prvi"/>.  

== Preverjanje izventarčnih učinkov ==

Dolgotrajno izražanje CRISPR/Cas9 sistema povezujejo z izventarčno aktivnostjo. Da bi določili, če je z načrtovanim sistemom prišlo do izventarčnih učinkov so, s pomočjo spletnega orodja [http://www.rgenome.net/cas-offinder/ »Cas-offinder«], poiskali potencialna izventarčna mesta ter izbrali 5 najverjetnejših za gRNA-HDAC3 ter 5 za gRNA-DNTM1. Od tarčnih zaporedij se vse gRNA razlikujejo le za 2 do 3 mest neujemanja. V pripravljene klone z endogeno izbitimi geni so prenesli posamezne gRNA in pričakovana izventarčna mesta sekvencirali po Sangerju. Tako pri HDAC3 in DNTM1 niso zaznali izventarčnih učinkov, venadr niso izvedli sekvenciranja celega genoma (WGS) <ref name="prvi"/>. 

== Zaključek ==

Znanstvenikom je uspelo vzpostaviti metodo za pogojno izbijanje esencialnih genov, s katero je možno preučevati tudi vpliv točkovnih mutacij. V tem sistemu KO plazmid služi izbijanju in ohranjanju plazmida RP, ki omogoča eksogeno inducibilno izražanje izbitega gena. 


== Viri ==
<references/>