View source for Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov

Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.3c00588# Subunits of an E3 Ligase Complex as Degrons for Efficient Degradation of Cytosolic, Nuclear, and Membrane Proteins] 


== Razgradnja proteinov s proteosomom ==

Večina proteinov v sesalskih celicah se razgradi skozi ubikvitin-proteosomsko pot, ki omogoča negativno kontrolo aktivnosti proteinov. Na lizinske ostanke kovalentno vezani ubikvitini (Ub) služijo, kot signal za 26S proteosom, ki vodi v razgradnjo označenega proteina. Ubikvitinsko post-translacijsko modifikacijo katalizira encimska kaskada, katero sestavljajo proteini E1, E2 ter E3.

E1 ali ubikvitin-aktivacijski protein ob porabi ATP-ja katalizira prvi korak ubikvitinacijske reakcije, tako da aktivira Ub s tvorbo tioesterske vezi s C-koncem Ub. Aktiviran Ub se prenese na ubikvitinski nosilec E2. Tako nastali intermediat E2-Ub interagira z ubikvitin ligazo ali E3, ki katalizira prenos Ub z E2 ter tvorbo nove izopeptidne vezi na lizinskemu ostanku substrata (tarčnega proteina). Za razgradnjo označeni substrati so nato razgrajeni s strani proteosoma.

E3 ligaze služijo kot ključni regulatorji ubikvitin-proteosomske poti, saj kontrolirajo specifičnost in učinkovitost prenosa Ub. Dokaz izredne specifičnosti E3 ligaz je dejstvo, da poznamo preko 600 različnih encimov te vrste. Večina človeških E3 ligaz je tipa RING (ang. really interesting new gene), te ligaze omogočajo direkten prenos Ub iz E2 na substrat brez tvorbe E3-Ub intermediata.

== Sesalske E3 ligaze  ==

Primer RING ligaze je sesalski SCF-Skp2 E3 ligazni kompleks, ki je strukturno dobro okarakteriziran. Sestavljajo ga protein cullin 1 (Cul 1), ki deluje kot ogrodje, na katerega se nalagajo drugi proteini - protein Rbx1 (ang. RING-box protein 1), ki se veže na C-konec Cul1, in Skp1 (ang. S-phase kinase-associated protein 1), ki se veže na N-konec Cul1. Medtem ko Rbx1 omogoča izmenjavo E2-Ub intermediata preko domene RING, Cul1 vmesti substrat in E2-Ub v optimalno prostorsko orientacijo za prenos Ub.

Specifičnost E3 ligaz je dodatno okrepljena z vezavo specifičnih adapterskih proteinov, kot je na primer Skp1. Skp1 proteini delujejo kot adapterji, ki omogočajo vezavo drugih proteinov z motivom F škatle (Skp2). Medtem ko je N-konec F-škatle ohranjen in omogoča interakcijo z E3 ligazo, je C-konec manj ohranjen, pri čemer s posledično večjo sekvenčno in konformacijsko variabilnostjo omogoča vezavo vrste različnih substratov.

== Tarčna razgradnja preko genskih fuzij z E3 ligazo ==

Ključen dejavnik uspešnosti prenosa Ub ter nalaganje le-tega in tvorbe poliubikvitinske verige je medsebojna bližina med substratom in E2-Ub. Da bi preverili vpliv bližine substrata in E2, so pripravili genetske fuzije reporterskega proteina luciferaze, ki je služila kot substrat, in ubikvitin konjugirajoči encim E2 R1 (CDC34 E2), ki asociira s SCF (ime izvira iz začetnic Skp, Cul in F-škatla) družino E3 ligaz ter dokazano katalizira nastanek na lizin povezanih poliubikvitinskih verig.

Asociacija substrata s podenotami kompleksa E3 ligaze je prav tako povezana z uspešnostjo razgradnje tarčnega proteina. Da bi raziskali, kako vezava posameznih podenot vpliva na razgradnjo substrata so z luciferazo gensko združili domene E3 ligaznega kompleksa (F-škatlo Skp2, Skp1, Rbx1 in C-terminalni konec Cul1).

Fuzije luciferaze in podenot SCF-Skp2 E3 ligaznega kompleksa so vodile v nižjo raven luciferazne aktivnosti, kar pomeni, da fuzijski konstrukti negativno vplivajo na učinkovitost razgradnje proteinov. Zmanjšano aktivnost luciferaze zaznamo tudi pri vzorcih, kjer sta združena substrat in E2. Najmanjšo aktivnost luciferaze so kazali vzorci s fuzijo substrata in Cul1 ter substrata in F-škatle.

F-škatla, ki se nahaja tudi v proteinu Skp2 je ključna za interakcijo s Skp1 ter nadaljnjo razgradnjo substrata. Skp1 in Skp2 interagirata preko štirih C-terminalnih vijačnic. Da bi dodatno povečali sposobnost razgradnje proteinov s strani Skp1 so uvajali mutacije in odstranjevali povezovalne vijačnice ter pokazali, da je aktivnost luciferaze najnižja v vzorcih, kjer ima Skp2 le eno C-terminalno vijačnico.

Rbx1 se z beta-ploskvijo veže na Cul1, delecije v tej regiji so vodile v povečanje aktivnosti luciferaze v primerjavi z vzorcem brez mutacije. Beta-ploskev Rbx1 očitno vpliva na učinkovitost destabilizacije substrata.
Podenote kompleksa SCF-Skp2 E3 lahko delujejo kot degroni – minimalni elementi v proteinu, ki omogočajo tarčenje substrata za ubikvitinsko-proteosomsko mediirano razgradnjo.

== Preiskovanje posameznih degronov  ==

Za preiskovanje posameznih degronov in povezovanje degronov in substrata so uporabili heterodimere obvitih vijačnic (CC). To so strukturni motivi - supervijačnice tipično v obliki dimerov ali trimerov. Dejansko jih lahko sestavlja do 7 alfa-vijačnic. So eden od proteinskih motivov, kjer je odnos med sekvenco in strukturo do velike mere že določen. Omogočajo načrtovanje in sestavljanje modularnih proteinov, ki se odzivajo na pričakovan način.
 
Zaradi predvidljivega obnašanja CC so te zelo uporabne za zagotavljanje povezanosti določenih proteinov ali proteinskih domen. Da bi preučili posamezne degrone in zagotovili povezanost degronov s substratom (luciferazo) so pripravili genetske fuzije CC s substrati in degroni. Vijačnici v obeh genetskih fuzijah sta si komplementarni oz. imata afiniteto druga z drugo. Uspešna interakcija CC substrata in degrona povzroči padec aktivnosti luciferaze, s tem da se aktivnost luciferaze dodatno zmanjša pri parih CC z nižjimi afinitetami.

Prostorska orientacija substrata glede na ligazni kompleks je izredno pomembna, zato je učinkovitost razgradnje substrata odvisna od rigidnosti povezovalnega zaporedja med CC in proteinom ter med CC in degronom. Povezovalna zaporedja so fleksibilna. Sestavljena so iz glicinskih in serinskih ponovitev, njihova optimalna dolžina je odvisna glede na tip degrona. V splošnem so daljša povezovalna zaporedja med substratom in CC vodila v večjo raven razgradnje. Daljša povezovalna zaporedja med CC in degronom pa so vodile v manjšo raven razgradnje. Fleksibilnost substrata, prav tako kot rigidnost degrona izboljša procesivnost ligaze.

== Fuzije s CC zaradi ugodnih lastnosti teh motivov omogočajo vrsto načinov regulacije razgradnje proteinov: ==

=== Substrat z dvema CC, ki sta povezana z mestom, katerega razgradi TEV proteaza ===

Vezava dveh različnih CC motivov z različnimi funkcijami na substrat omogoča regulacijo razgradnje tarčnega proteina. Zunanja CC veriga ni sposobna vezave na CC degrona in preprečuje interakcijo druge CC substrata, ki bi lahko interagirala z degronom. Delovanje TEV (ang. Tobacco Etch Virus nuclear-inclusion-a endopeptidase) proteaze povzroči odcep in disociacijo »inhibitorne« CC - CC, ki je sposobna interakcije z degronom ni več senčena, zaradi njene izpostavitve pride do ubikvitinacije substrata in posledične razgradnje. Do razgradnje substrata bo prišlo dokler so TEV proteaze aktivne, to pa pomeni, da razgradnja proteinov ne mora biti regulirana v krajših časovnih intervalih.

=== Uporaba majhnih molekul za nadzorovanje razgradnje proteinov ===

FKBP (ang. FK506 binding protein) in FRB (ang. FKBP-rapamycin binding) domeni v prisotnosti rapamicina dimerizirata. To lastnost uporabimo za povezavo degrona z substratom ob prisotnosti majhne molekule. Dimerizacijo degrona in substrata dosežemo s fuzijo substrata s FKBP domeno ter degrona s FRB domeno. Kemična dimerizacija ob prisotnosti rapamicina vodi v ubikvitinacijo substrata.

Prednost uporabe majhne molekule je predvsem v tem, da je njen vnos in njeno izpiranje iz gojišč hitro. Do dimerizacije domen pride že v roku 30 minut.

== Preverjanje sposobnosti razgradnje transmembranskih in jedrnih proteinov ==

Degroni, ki izhajajo iz SCF-Skp2 E3 ligaznega kompleksa, lahko zagotovo razgradijo citosolne proteine. Za aplikacije v raznih terapijah bi bilo zaželeno, da so sposobni razgraditi tudi jedrne in membranske proteine. Destabilizacija membranskih proteinov je posebej zanimiva za terapijo CAR-T (ang. chimeric antigen receptor – T cells), kjer himerni transmembranski celični receptorji omogočajo tarčenje rakavih celic. Povišana količina CAR v teh celicah lahko v nekaterih primerih vodi v neželene stranske učinke zaradi prekomerne aktivacije, kot so npr. citokinske nevihte.

Da bi preverili sposobnost razgraditve transmembranskih proteinov so genetsko združili CAR s fluorescenčnim proteinom in FRB domeno, tako so ob prisotnosti rapamicina lahko spremljali upadanje fluorescence, ki je predstavljala uspešno razgradnjo CAR. Razgradnja proteina je bila manj uspešna, zato so se odločili ustvariti degrone iz drugih ubikvitin ligaznih kompleksov. Degroni iz CRL5-SOCS2 E3 ligaznega kompleksa so omogočili uspešnejšo razgradnjo.

Sposobnost razgradnje proteinov v jedru so preverili z gensko fuzijo luciferaze in degrona z jedrnim lokalizacijskim signalom ter dimerizacijskima domenama. V prisotnosti rapamicina so zaznali destabilizacijo proteinov tudi ko so uporabljali samo degrone iz kompleksa SCF-Skp2 E3.

Degroni iz SCF-Skp2 E3 ligaze so očitno ustrezni za razgradnjo citosolnih in jedrnih proteinov. Zaradi manjše učinkovitosti pri proteinih, ki se nahajajo v membrani degroni, ki izvirajo iz SCF-Skp2 E3 ligaze očitno nimajo lokacijsko nespecifične aktivnosti. Za nastanek bolj univerzalnih degronov so ustvarili proteine, ki poleg Skp1 vsebujejo tudi vezavni motiv škatlo SOCS (ang. suppressor of cytokine signaling). Ta izvira iz CRL5-SOCS2 E3 ligaznega kompleksa in je uporabna za razgraditev membranskih proteinov. Takšen sistem omogoča tarčno razgradnjo proteinov v vseh treh kompartmentih.

== Zaključek ==

Ker so E3 ligaze esencialne v razgradnji proteinov, so visoko ohranjene, kar pomeni, da je metoda uporabna na več različnih celičnih linijah. Inducibilna razgradnja proteinov, katero lahko kontroliramo hitro in učinkovito, bi lahko služila kot zanimiv način za regulacijo in študije proteinskih nivojev v celicah.

== Literatura ==

[1]	A. Verbič, T. Lebar, A. Praznik, R. Jerala: Subunits of an E3 Ligase Complex as Degrons for Efficient Degradation of Cytosolic, Nuclear, and Membrane Proteins. ACS Synth Biol 2024, 13, 792–803.

[2]	A. L. Boyle: Applications of de novo designed peptides. Peptide Applications in Biomedicine, Biotechnology and Bioengineering 2018, 51–86.