AureoBos

Skupina Tec-Chihuahua iz Mehike je s svojim projektom AureoBos prejela zlato medaljo za najboljši projekt na področju hrane in prehrane. Več o njihovem projektu najdemo na naslednji povezavi: https://2023.igem.wiki/tec-chihuahua/description Avtorica povzetka: Tina Javeršek

Uvod

Mleko je dragocena dobrina in po ocenah več kot 6 milijard ljudi vsakodnevno uživa mlečne izdelke, ki predstavljajo pomemben vir različnih hranil. S proizvodnjo mleka se ukvarja približno 150 milijonov gospodinjstev po vsem svetu, sama proizvodnja in poraba pa v zadnjih letih naraščata. Mastitis je pogosta in razširjena bolezen pri kravah molznicah in letno prizadene okoli 5,4 milijona krav. Rejcem povzroča znatne stroške, ki vključujejo diagnostiko, zdravljenje in posebno nego živali. Bolezen negativno vpliva na sestavo, količino in kakovost mleka, hkrati pa lahko trajno okvari vime in tako ovira prihodnjo proizvodnjo mleka prizadetih krav. Trenutno zdravljenje vključuje predvsem uporabo antibiotikov, zato so rejci prisiljeni, da umaknejo mleko iz prodaje. Goveji mastitis tako predstavlja glavni vzrok za finančne izgube v mlečni industriji in v ZDA znaša v povprečju 200 dolarjev na kravo letno [1], [2].

Cilji projekta

Ekipo iz zvezne države Chihuahua je pritegnila problematika mastitisa in njegovega vpliva na lastnike mlekarn. Navdihnilo jih je delo prejšnjih ekip iGEM (2017 TU Delft in 2021 IISER Kolkata), katerih projekt se osredotoča na diagnozo mastitisa. Projekt iGEM Tec-Chihuahua 2023, imenovan AureoBos, se osredotoča na razvoj neantibiotičnega zdravljenja mastitisa. Prizadevajo si zmanjšati količino mlečnih odpadkov s hitrejšim zdravljenjem mastitisa, kar zmanjša potrebo po zavrženju mleka zaradi okužbe ali prisotnosti ostankov antibiotikov. Povečali bi varnost hrane in potrošnike zaščitili z zmanjšanjem ostankov antibiotikov v mlečnih izdelkih ter zagotovili manjše tveganje za patogene, ki so odporni na antibiotike. Odpornost mikrobov na antibiotike je namreč ena izmed največjih groženj javnemu zdravju. Rejcem, ki se ukvarjajo z mlečno industrijo, bi olajšali položaj z zagotavljanjem učinkovite in trajnostne rešitve, ki bi izboljšala zdravje ter produktivnost živali in tako zmanjšala njihove proizvodne stroške. Projekt se osredotoča na ustvarjanje baktericidnega zdravljenja z uporabo rekombinantnih endolizinov, katerih tarča so glavni povzročitelji bolezni.

Mastitis

Najpogostejši mikroorganizmi, za katere je znano, da povzročajo goveji mastitis so Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis in Escherichia coli. Omenjeni patogeni so zelo pomembni v kontekstu reje mleka zaradi nepopravljive škode, ki jo povzročijo na molznem tkivu. Ko patogene bakterije vdrejo v mlečno žlezo, poškodovane mlečne celice sproščajo citokine, ki pritegnejo levkocite iz krvnega obtoka v mleko. Povišano število somatskih celic v mleku je močno povezano s spremembami v kakovosti mlečnih beljakovin, deležu maščobnih kislin in vsebnosti mineralov [1].

Viri okužbe

Vir okužbe za nastanek mastitisa predstavlja oprema za molžo, kjer nedelujoči molzni stroji olajšajo povratni tok bakterij v vime. Za prenos patogenov so lahko odgovorni tudi vektorji (npr. muhe) ali pa prenos poteka preko posteljnega materiala (zemlja, slama, žagovina). Okužba je prav tako povezana z nakupom novih krav, ki lahko v čredo vnesejo nove seve patogenov.

Povzročitelji

S. aureus je glavni patogen, odgovoren za goveji mastitis in proizvaja škodljive toksine in encime. S. agalactiae sodeluje pri nastanku bakterijskih biofilmov, ki nudijo zaščito pred učinki antibiotikov. Neustrezno upravljanje z antibiotiki tako povečuje odpornost patogenov, zato je nujno ozaveščanje o uporabi antibiotikov v prehranski verigi.

Znaki okužbe

Okužbe z mastitisom se kažejo v treh oblikah. Pri subklinični stopnji okužba ni vidno opazna, ob neustreznem zdravljenju pa lahko napreduje do klinične stopnje. Slednja je stanje, ko simptomi mastitisa postanejo opazni in se proizvodnja kravjega mleka zmanjša. Izraz kronični mastitis se nanaša na stanje, pri katerem se okužba nenehno vrača in se simptomi klinične stopnje znova pojavijo. Nezdravljen mastitis zmanjša proizvodnjo mleka, lahko poškoduje kravje vime in pri hudih primerih tudi povzroči smrt krav [1].

Zdravljenje

Primarno zdravljenje mastitisa vključuje uporabo antibiotikov, kot so naravni ali sintetični penicilini. Prekomerna uporaba teh lahko vodi v odpornost in neodzivnost, kar dodatno poviša stroške zdravljenja in ogrozi javno zdravje. Čeprav so antibiotiki učinkoviti, je velika pomanjkljivost njihove uporabe ta, da zahtevajo karenco, ki prepoveduje zbiranje mleka za prehrano ljudi. Obstaja tudi nekaj alternativnih načinov zdravljenja, kamor prištevamo intramamarno infuzijo, terapijo suhih krav, cepljenje, zdravljenje s probiotiki in zdravilna zelišča.

AureoBos

AureoBos je intramamarna infuzija endolizinov, ki se neposredno vnesejo v vime skozi sesni kanal.

Endolizini

Endolizini so peptidoglikanske hidrolaze, ki jih proizvajajo bakteriofagi in razgrajujejo peptidoglikan v bakterijskih celičnih stenah, kar omogoča sproščanje novih virusnih delcev iz okuženih celic. Kljub velikemu potencialu pri boju proti bakterijskim okužbam je njihova uporaba omejena zaradi izjemno kratke razpolovne dobe in vivo, ki znaša le 20 minut [3].

Izboljšave endolizinov

Za reševanje izzivov, kot je struktura celične stene gram-negativnih bakterij in kratka življenjska doba endolizinov, so sintetizirali so tri rekombinantne endolizine: LysCSA13, LysK in LysSS. LysCSA13 in LysK se uporabljata predvsem za gram-pozitivne bakterije. Omenjena endolizina sta sestavljena iz dveh domen: N-končne naravne katalitične domene (CHAP) in domene vezave na celično steno (SH3), ki sta povezani s kratkim fleksibilnim povezovalnikom. Proteina imata podaljšano življenjsko dobo, ki so jo dosegli z vključitvijo domene, ki veže albumin. Gram-negativne bakterije predstavljajo izziv za endolizine zaradi neprepustne lipopolisaharidne plasti v celični steni. V ta namen so modificirali endolizine s peptidi, ki destabilizirajo lipopolisaharide (LPS). Nastali artilizini lahko prekinejo in prodrejo v lipopolisaharidno plast ter tako povzročijo lizo bakterijskih celic. Pri AureoBos so pripravili protein v obliki fuzije iz endolizina LySS, polikationska nonapeptid in CeCA, ki je protimikrobni peptid. Izboljšano sposobnost liziranja celic proti Streptococcus agalactiae in Streptococcus uberis so dosegli z vključitvijo domene SH3B30 in proti Staphylococcus aureus in Escherichia coli s spajanjem endolizina s polikationskimi peptidi (PCNP) in CecA [3],[4],[5]. Kot sistem za dostavo endolizinov AureoBos uporablja hitozan-alginatne nanodelce, pri čemer se izkorišča protimikrobne lastnosti hitozana za povečanje baktericidnega učinka. 30-urno podaljšanje življenjske dobe so dosegli z vključitvijo albumin vezavne domene. Končno so vključili mesto cepitve TEV za odstranitev HisTag po čiščenju proteinov.

Rezultati

Kodirajoča zaporedja treh rekombinantnih proteinov so bile modificirane in silico, da bi vnesli mesta za prepoznavanje encima BsaI. Različne komponente, vključno s promotorjem, vezavnim mestom za ribosom (RBS) in terminatorjem so bile sestavljene z uporabo programske opreme SnapGene in metode Golden Gate ter encimom Bsal.

Eksperimentalna validacija

Za eksperimentalno validacijo so rekombinantne plazmide vnesli v bakterije. S selekcijo z antibiotiki so identificirali uspešno transformirane bakterije. Nato so izvedli encimsko razgradnjo in elektroforezo za potrditev pravilnega sestavljanja plazmidov.

Indukcija izražanja in izolacija proteinov

Po uspešni pridobitvi konstruktov so te transformirali v celice E.coli BL21 (DE3) za ekspesijo. Izražanje rekombinantnih proteinov so inducirali z dodajanjem IPTG, pri čemer so izvajali kratke indukcije pri koncentracijah 0,2, 0,5, in 1,0 mM IPTG za 6 ur, pri čemer so vzorce odvzeli vsako uro, da bi spremljali dinamiko indukcije. Za oceno optimalnih pogojev indukcije so izvedli SDS-PAGE na poliakrilamidnem gelu. Po določitvi optimalnih indukcijskih pogojev so vsak endolizin ustrezno inducirali in nato prečistili z izvedbo Ni-afinitetne kromatografijo, kjer so izkoristili heksahistidinske oznake na proteinih.

=Optimizacija in testiranje

Cilj nadaljnjih bakterijskih testov je bil identificirati najučinkovitejše kombinacije in koncentracije endolizinov za ciljanje specifičnih bakterij. S tem so optimizirali pripravljene fuzijske proteine za največjo učinkovitost pri uničevanju ciljnih bakterij.

Zaključek

Projekt AureoBos predstavlja pomemben korak naprej v boju proti bakterijskim okužbam, še posebej mastitisu pri živalih. S pomočjo naprednih rekombinantnih endolizinov, ki vključujejo inovativne prilagoditve za izboljšano stabilnost in učinkovitost, ponujajo obetavno rešitev za težave, povezane z odpornostjo bakterij na antibiotike. S tem projekt AureoBos ne prispeva le k obvladovanju mastitisa, ampak tudi k reševanju širše problematike odpornosti na antibiotike, kar je ključnega pomena za zdravje živali in ljudi.

Viri

[1] D. R. Bruno, R. M. Cleale, G. Jardon, T. Short, B. Mills, J. R. Pedraza: Outcomes after treatment of nonsevere gram-negative clinical mastitis with ceftiofur hydrochloride for 2 or 5 days compared with negative control. J Dairy Sci 2024, 107, 2390–2405. [2] S. Miyata, L. Fan, J. Kambe, M. I. Qasimi, S. Takemoto, M. Ito, C. Li, Y. Yamamoto, K. Nagaoka: Influence of repeated mastitis on the milk production and metabolic status in the subsequent lactation period of dairy cattle. Heliyon 2024, 10, e29789. [3] Y. Briers, M. Walmagh, V. Van Puyenbroeck, A. Cornelissen, W. Cenens, A. Aertsen, H. Oliveira, J. Azeredo, G. Verween, J.-P. Pirnay, et al.: Engineered Endolysin-Based “Artilysins” To Combat Multidrug-Resistant Gram-Negative Pathogens. mBio 2014, 5. [4] M. ur Rahman, W. Wang, Q. Sun, J. A. Shah, C. Li, Y. Sun, Y. Li, B. Zhang, W. Chen, S. Wang: Endolysin, a Promising Solution against Antimicrobial Resistance. Antibiotics 2021, 10, 1277. [5] J. Borysowski, B. Weber-Dąbrowska, A. Górski: Bacteriophage Endolysins as a Novel Class of Antibacterial Agents. Exp Biol Med 2006, 231, 366–377.