Razvoj in optimizacija modularnega dvofragmentnega LacI stikala za naprednejšo biodetekcijo

Povezava do izhodiščnega članka: https://link.springer.com/article/10.1007/s12257-024-00020-w

1. Uvod

Genska stikala (genetic switches) so ključni elementi za regulacijo izražanja specifičnih genov. Zaradi njihovega širokega spektra delovanja in modularnosti so v sintezni biologiji ključnega pomena. Eni najpogosteje uporabljenih genskih stikal so transkripcijski faktorji. Slednji premorejo veliko potenciala za optimizacijo različnih postopkov pri molekulskem inžinjiringu in različnih področjih diagnostike. [1]

V članku Development and optimization of a modular two-fragment LacI switch for enhanced biosensor applications je raziskovalna skupina predstavila potencialno uporabo represorja laktoznega operona LacI za detekcijo prisotnosti specifičnih proteinov ali interakcije med njimi. Predstavljen princip temelji na metodi z razcepljenimi proteini. LacI so razcepili na dva fragmenta. Na DNA vezavno domeno in regulatorno domeno. Na oba fragmenta sta pripeta peptida, ki sta med seboj komplementarna. Komplementarna peptida omogočata spajanjenje obeh LacI fragmentov v funkcionalen LacI represor, ki se veže na operatorsko regijo Lac operona in zavre prepisovanje genov operona. Z izbiro ustreznega komplementarnega peptida, bi lahko detektirali prisotnost tarčnega proteina, ki bi z vezavo na komplementarno regijo fuzijskega proteina preprečil spajanje LacI fragmentov v aktivni encim. Posledično ne bi prišlo do represije reporterskih genov na operonu, kar bi zaznali z detekcijo signala. [1, 2]

2. Metode za razvoj sistema

Poglavitni problem pri razvoju metode je bilo ugotoviti, kako bi LacI razdelili na dve fuzijski podenoti, ki bi po ponovni združitvi povrnili prvotno vlogo proteina. V ta namen je bilo potrebno pripraviti knjižnico zaporedij LacI z vstavljenim določenim zaporedjem na naključnih različnih mestih. Za namen lažje selekcije v kasnejših stopnjah, so se odločili, da bodo znotraj LacI gena vstavili transpozonsko zaporedje za ojačan zeleni fluorescenčni protein z markerjem za odpornost proti kanamicinu (eGFPuv-KanR). Slednji bi omogočal selekcijo vseh kolonij, kjer je prišlo do uspešne združitve obeh podenot preko zelene emitirane svetlobe, medtem ko bi povrjeno aktivnost lacI detektirali preko represije sekundarnega reporterskega sistema (zapis za RFP) lac operona na ločenem plazmidu. [1]

2.1. Konstrukcija sevov

Za namen selekcije so morali v začetni stopnji v genom izbranega seva (DH5α) uvesti okvarjen gen za lacI represor. Okvaro so dosegli z rekombinacijo s pomočjo rdečega lambda bakteriofaga. Z rekombinacijo so v kromosom ustavili kaseto, ki so jo vzeli iz seva BW25113ΔlacI::KmR, pomnožili z metodo PCR. Zaporedje so preverili s sekvenciranjem zaporedja ter izvedli rekombinacijo s pomočjo vektorja pKD46. Vstavljena kaseta je poleg okvarjenega lacI gena vsebovala tudi selekcijski marker za odpornost proti kanamicinu. Po selekciji v gojišču ob prisotnosti kanamicina so prenesli ustrezne kolonije in zaporedje preverili s ponovno metodo PCR. V nadaljevanju so selekcijski marker odstranili s flipazo. [35]

2.2. Konstrukcija plazmidov

Za namen selekcije kolonij DH5α z delujočim sistemom je bilo potrebno konstruirati dva plazmida. Prvi (pUCBB-eGFP) je vseboval zapis za lacI represor z vstavljenjim zaporedjem za eGFP pod konstitutivnim lacO promotorjem in selekcijskim markerjem za kanamicin, ki je bil kasneje odstranjen z NheI z nadaljno ligacijo z T4 ligazo. Drugi (pACBB-mRFP) je vseboval trc promoter, lac operator in zaporedje za mRFP. Za združevanje segmentov DNA so uporabili In-Fusion Cloning Kit (Clontech). [1]

2.3. konstrukcija in vstavljanje transpozonske regije Tn5[GFPuv]

Transpozone z GFP zaporedjem in markerjem za odpornost proti kanamicinu so dobili z vstavljanjem gfpuv gena iz pGFPuv (Clontech) v transpozon EZ-Tn5 (Epicentre) pred zapisom za gen KmR. Transpozonsko regijo so očistili z gelsko ekstrakcijo (Qiagen kit). 87 fm očiščenega transpozona so z ekvivalentno molsko maso tarčnega plazmida pUCBB-LacI 2 uri inkubirali v 10 µL Tris acetatnega pufra z 1 enoto EZ::TN™ (In-Frame Linker Insertion Kit; Epicentre) in 25 % glicerolom pri 37 %. Transpozicijo so po 2 urah ustavili z dodatkom 0.1% SDS in 10-minutno inkubacijo pri 70 °C. V nadaljevanju so z plazmidom transformirali E. coli DH5α z elektroporacijo ter bakterije gojili na ploščah ob prisotnosti ampicilina in kanamicina. Plazmid so iz kolonij, kjer je prišlo do inscercije transpozona izolirali z izolacijskim setom (Qiagen). [1]

3. Rezultati in diskusija

3.1. Identifikacija dostopnega cepitvenega mesta LacI represorja

Po transformaciji DH5α z obema plazmidoma (pACBB-mRFP in pUCBB-eGFP) so celice gojili na ploščah. Pri kolonijah, kjer je ni bilo zelene fluorescence, ni prišlo do spajanja podenot LacI represorja. V primeru, ko sta bili prisotni obe fluorescenci, je sicer prišlo do spajanja obeh podenot, saj je bil GFP funkcionalen, a je bil tronspozon vstavljen na takem mestu, da tudi po združitvi fragmentov LacI ni prišlo do povratka prvotne funkcije proteina, saj ni prišlo do represije izražanja RFP genov. Ustreznih kolonij, ki so fluorescirale zgolj z zeleno barvo je bilo 34 (od skupno ~ 1.6 × 104). Od tega so v nadaljevanju izbrali in izolirali 13 proteinov, kasneje pa s strukturno analizo izbrali 4 kandidate, ki so imeli cepitvena mesta na P155, N157, L307 in G315. Vsi kandidati so kasneje pokazali vsaj 1,6-kratno povečanje fluorescence ob prisotnosti 1mM IPTG. Ko so testirali spremembo fluorescence v primerih, ko je bil prisoten zgolj en od obeh fragmentov, spremembe fluorescence kot pričakovani ni bilo.

3.2. Testiranje delovanja sistema s komplementarnimi levcinskimi zadrgami

V nadaljevanju so izvedli dodaten poskus s pripenjanjem dveh fragmentov lizinske zadrge na kandidata P155 in G315. Pri obeh kandidatih je prišlo do znižanja fluorescence v primerjavi s kontrolnimi skupinami, ki so vsebovale zgolj eno od obeh peptidov na fragmentih razcepljenega LacI. Znižanje je bilo moč zaznati tako ob prisotnosti, kot tudi ob odsotnosti IPTG. Dodatno so preizkusili tudi obnašanje sistema in vitro v celicah E. Coli, ki so jih inkubirali pri različnih koncentracijah IPTG (od 0 do 100 µM). Pri obeh kandidatih je prišlo do precej visoke fluorescence v odsotnosti od IPTG, kar nakazuje, da po vsej verjetnosti ni prišlo do ustreznega sestavljanja podenot v funkcionalen encim, kar bi lahko brez ustrezne optimizacije v praksi povzročilo precej omejitev z vidika občutljivosti metode.

3.3. Brezcelični sistem

Reporterski fluorescenčni gen so poskusili izraziti z uporabo kompleta za in vitro sintezo beljakovin PURExpress®. Izražanje je bilo doseženo z dodatkom fragmentov razcepljenega LacI in fuzijskimi peptidi ter induktorjem IPTG. Spremljali so spremembe v intenzivnosti fluorescence skozi čas v serijskih reakcijah za tri različice LacI (divji tip, P155 in G315). Kot pričakovano, je divji tip LacI pokazal od IPTG-odvisen odziv. Fluorescenčni signal se je s časom povečeval, z največjo spremembo za 1,6-krat po 3-urni reakciji. Ta sprememba je primerljiva z in vivo testom, kar kaže, da sistem deluje primerljivo tudi v in vitro okolju. V primeru razdeljenega LacI-155 in -315, s komplementarnimi proteini, se je IPTG-odvisen signal prav tako povečevala do 3 ure. Rezultati opredeljujejo uspešno delovanje modularnega dvodelnega sistema ob uporabi CFPE (cell free protein expression) tehnologije, kar ga naredi primernega za številne analitične aplikacije.

3.4. Optimizacija sistema

Cilj optimizacije je bil čim bolj zmanjšati vplive ozadja (nespecifično fluorescenco). Problema so se avtorji članka lotili tako, da so signal dobljen z uporabo razcepljenega lacI primerjali z wild-type signalom pri različnih vrednostih IPTG ter DNA. Ugotovili so, da fluorescenca doseže plato pri 200 µM IPTG. Najboljše razmerje signal-ozadje pa je bilo doseženo pri 100 ng DNA (glede na standard seta PURExpress®).

4. Zaključek

Predstavljen sistem na principu razcepljenih transkripcijskih faktorjev ponuja številne možnosti za napredek diagnostičnih metod in študij interakcij. Ko se tarčne molekule vežejo na eno od proteinskih oznak, te konkurenčno zavirajo ponovno sestavljanje fragmentov LacI, kar ima za posledico neprekinjeno aktivacijo izražanja reporterskega gena neodvisno od IPTG. Te fuzijske beljakovinske oznake ponujajo fleksibilnost in jih je mogoče zamenjati glede na interes tarče, kar je prednostno za razvoj različnih biosenzorjev. Dodatna prednost je možnost uporabe sistema v izvenceličnem okolju. Čeprav predstavljen sistem ne ponuja toliko potenciala z vidika identifikacij velikega števila interakcij, kot ga ponujajo tradicionalni sistemi, kot na primer dvohibridni sistem kvasovk, avtorji članka ob ponujenih možnostih za optimizacijo, navajajo prednosti sistema predvsem v enostavnosti, hitrosti in obstojnosti sistema zaradi možnosti izvedbe v izvenceličnem sistemu (CFPE), kar bi pomenilo precejšnjo prednost v medicinski diagnostiki, ki omogoča detekcijo že na samem mestu odvzema vzorca (point-of-care). [1]