Gensko spremenjeni receptorji za komunikacijo med celicami preko topnih signalov in zaznavanje bolezni

Izhodiščni članek: [1]

Uvod

Celice med sabo in z okolico primarno komunicirajo s pomočjo majhnih difuznih molekul. Celice jih tvorijo, zaznajo prek receptorjev in nanje reagirajo. To jim omogoča koordinacijo funkcij in odzivanje na signale iz okolja [1]. Ligande celičnih receptorjev oz. celične sporočevalce delimo na hidrofobne in hidrofilne. Med hidrofobne (netopne) uvrščamo steroidne hormone in pline. Zanje je značilno, da prehajajo celično membrano z difuzijo in se vežejo na receptorje znotraj celic. Med hidrofilne (topne) uvrščamo citokine, rastne faktorje, nevrotransmiterje, peptidne hormone, nukleotide in nukleozide (ATP). Ker ti ne morejo preiti celične membrane, se vežejo na površinske receptorje na tarčni celici, ki aktivirajo celični odziv prek kaskade reakcij [2].

Čeprav je sintezna biologija sesalskih celic že precej napredovala, pa kljub vsemu še vedno ni na voljo sintetičnih modularnih površinsih receptorjev, ki bi vezali izbrane topne ligande in v celici aktivirali željene oz. točno določene celične funkcije. Takšni receptorji bi imeli velik terapevtski in klinični potencial, saj bi lahko regulirali aktivnost gensko spremenjenih terapevtskih celic [1].

CAR T

Dober primer aplikacije tovrstnega sistema je imunoterapija CAR T. Gre za terapijo, kjer pacientu odvzamejo T-celice. Slednje v laboratoriju genetsko spremenijo, da na površini izražajo kimerne antigenske receptorje (angl. CARs). Vezavno domeno teh receptorjev predstavlja v laboratoriju pripravljeno protitelo, ki ob vezavi antigena sproži aktivacijo receptorja, ki stimulira transkripcijo genov, ki so ključni za funkcije T-celic. Spremenjene T-celice vnesemo v pacienta. Kimerni antigenski receptorji vežejo specifične proteine oz. antigene, ki so značilni za rakave celice (zato jih je največ v okolju, kjer se nahajajo rakave celice) in tako pomagajo T-celicam pri bolj tarčnem odstranjevanju rakavih celic [3]. Pomanjkljivost teh receptorjev je, da lahko inducirajo le naravne funkcije T-celic, kot je izločanje citokinov. Imunski odziv, ki spodobuja vnetje in citotoksičnost pa ni vedno zaželjen pri vseh vrstah celičnih terapij, sploh če želimo zgolj dostaviti terapevtske molekule na tarčno mesto. Želeli pa bi si tudi dodatnih receptorjev, ki bi omogočili še bolj tarčno in specifično delovanje T-celic, saj običajni CAR-receptorji lahko vežejo le na membrano vezane ligande [1].

Drugi sintetični receptorji

Poleg kimernih antigenskih receptorjev so razvili tudi veliko drugih sintetičnih receptorjev. Tehnologije sintezne biologije so tako omogočile reguliranje fizioloških procesov z ustvarjenjem umetnih signalnih poti [4]. V začetku so se veliko ukvarjali s preoblikovanjem GPCR-receptorjev, vendar jih je zaradi številnih podenot težko vnesti v celice preko lentivirusnih ali z adenovirusi povezanih vektorjev. Poleg tega jim tudi primanjkuje fleksibilnosti pri izbiri ligandov [1], [4]. Potem so razvili receptorski sistem MESA (angl. modular extracellular sensor architecture), ki omogoča vezavo izbranega topnega liganda in prilagojen transkripcijski odziv stimulirane celice. Gre za sistem, ki vključuje dva transmembranska receptorja, ki se ob vezavi topnega liganda dimerizirata in aktivirata transkripcijo [4]. Je pa sistem imel težave pri ustrezni občutljivosti na ligand, prav tako pa je kompleksna struktura liganda oteževala vnos zapisa zanj v terapevtske celice [1]. Želeli bi si torej kompakten receptor, ki bi bil sestavljen zgolj iz ene verige in z ustrezno modularnostjo ter občutljivostjo za vezavo liganda. Ko ligand ni vezan, si želimo, da je bazalna transkripcija res minimalna, ko pa je vezan, si želimo močne transkripcijske aktivnosti [1]. To so želeli doseči s pomočjo priprave receptorja synNotch (angl. synthetic Notch). Gre za enoverižen receptor, ki je specifično oblikovan, da interagira s transmembranskimi proteini na tarčnih celicah. Tako kot nativni Notch-receptorji, imajo tudi synNotch na proteolizo občutljivo transmembransko sredico in znotrajcelični transkripcijski faktor, ki se ob vezavi liganda ocepi. Zunajcelična domena pa je zamenjana z domeno za prepoznavo antigenov, ki omogoča izbiro tarčnega liganda. Znotrajcelični transkripcijski faktor je prav tako zamenjan, glede na to, kateri celični proces želimo, da se aktivira ob vezavi liganda. Sam sistem synNotch pa ni žal primeren za vezavo topnih ligandov in zahteva kontakt z drugo celico in njenimi transmembranskimi proteini [4]. Da bi rešili ta problem so se odločili oblikovati nov receptor, ki temelji na Notch-signalizaciji, vendar lahko veže topne ligande [1].

Notch-signalizacija

Pri klasični Notch-signalizaciji pride ob interakciji z ligandom na Notch-receptorju do treh proteolitičnih cepitev, pri čemer se znotrajcelični fragment translocira v jedro, kjer vpliva na transkripcijo. Notch-receptorji se oblikujejo v endoplamzatskem retikulumu in se potem prenesejo v Golgijev aparat, kjer se razcepijo v heterodimere in se nato prenesejo na površino celice. Ob vezavi transmembranskega Notch-liganda na površini tarčne celice z Notch-receptorjem na površini terapevtske celice pride na receptorju do razkritja mesta proteolitične cepitve, ki ga prej zakrivajo LNR-ponovitve. Pride do druge proteolitične cepitve s proteazo ADAM10. Zatem sledi še tretja proteolitična cepitev z γ-sekretazo. Znotrajcelični fragment NICD (angl. Notch Intracellular Domain) se sprosti v notranjost citoplazme. Lahko ostane v citoplazmi in interagira z ostalimi signalnimi potmi, ali pa se translocira v jedro, kjer vpliva na transkripcijo. Notch-signalizacija je dobro evolcijsko ohranjena in je ključna pri razvoju zarodka, razvoju in obnovi tkiv ter tudi pri razvoju različnih rakavih in nerakavih obolenj [5].

SNIPR

Na osnovi Notch-receptorja so razvili sintetične intramembranske proteolitične receptorje – SNIPR (angl. synthetic intramembrane proteolysis receptor). Na topen ligand naj bi se odzvali robustno in selektivno, čeprav so iz strukture izpustili regulatorne LNR-ponovitve, ki v klasični Notch-signalizaciji veljajo za ključne za aktivacijo. Prav ta alternativna pot aktivacije naj bi SNIPR-receptorjem omogočila vezavo in aktivacijo tako z membranskimi, kot tudi s topnimi ligandi. Ta lastnost bi jih naredila zelo koristne za genski inženiring (npr. v okviru terapij proti raku) [1].

Zgradba

Receptor SNIPR je sestavljen iz: ligand vezavne domene (ki ga predstavlja fragment protitelesa scFv in omogoča modularnost vezave ligandov), ekstracelularne domene (ki se cepi s proteazo), transmembranske domene (ki se cepi z γ-sekretazo), znotrajcelične domene in transkripcijskega faktorja. Receptor so gradili postopoma in optimizirali posamezne podenote glede na efektivnost delovanja proteaz in moč transkripcije po vezavi liganda [6].

Testiranje

SNIPR receptorji ostanejo neaktivni v odsotnosti ligandov, vendar ob prisotnosti topnih ligandov sprožijo močan transkripcijski odziv, kljub temu da nimajo LNR-domen, za katere velja, da so ključne za uravnavanje aktivacije Notch-receptorjev. Domnevali so, da se SNIPR-receptorji aktivirajo preko alternativnega mehanizma v primerjavi s klasičnim modelom premika LNR-domen, ki je odvisen od mehanske sile ob kontaktu celic, ki razkrije proteolitično mesto za proteazo ADAM. To omogoča zaznavanje topnih ligandov, ki so sicer nedostopni receptorjem iz družine Notch. Za eksperimentalno potrditev efektivnosti receptorjev so oblikovali SNIPR-receptorje z ekstracelularno domeno, ki je imela vezane scFv-fragmente protiteles proti TGFβ in VEGF, ki sta značilni topni molekuli, ki ju povezujemo z rakom.Za kontrolo so opazovali običajne T-celice in pa synNotch-celice, za katere je značilno, da se odzovejo le na membrano vezane ligande. Kot reporterski protein so opazovali izražanje modrega fluorescentnega proteina. Ob dodatku posameznih ligandov so skladno s povečevanjem koncentracije opazili povečano flourescenco BFP. Slednje nakazuje, da SNIPR-receptorji lahko vežejo različne vrste ligandov in so primerni za zaznavanje z rakom ali z vnetjem povezanih topnih signalnih molekul [1].

Mehanizem aktivacije

Mehanizem aktivacije ne poteka mehansko prek vezave membranskega liganda, premika LNR-ponovitev in razkritja proteolitičnega mesta. Ker kljub temu, da v SNIPR-receptorjih ni prisotnih LNR-ponovitev in ob vezavi topnega liganda vseeno pride do aktivacije in fluorescenece BFP, vemo, da je stimulacija celice potekla po alternativni poti. Predlagan mehanizem vključuje endocitozo receptorja in vpliv pH na cepitev z γ-sekretazo, ki optimalno deluje v kislih območjih [1],[7]. Vsak korak aktivacije SNIPR-receptorja so preučevali z dodatkom ustreznega inhibitorja. Vsi receptorji, ki temeljijo na Notch-signaliziaciji (SNIPR, synNotch) so občutljivi na inhibicijo γ-sekretaze, kar povzroči dodatek inhibitorja DAPT. To nakazuje, da je v vseh primerih tovrstne signalizacije enak končni sprožilec, torej cepitev z γ-sekretazo, ki sprosti transkripcijski faktor v notranjost celice. Inhibicija ADAM10 proteaze, ki pa je ključna pri klasični mehanski aktivaciji Notch-receptorja, ni vplivala na aktivacijo SNIPR-receptorja s topnimi ligandi. Je pa zmanjšanje kislosti v endosomih s pomočjo inhibitorja endocitoze klorokina selektivno inhibiralo aktivacijo SNIPR-receptorjev, ki vežejo topne ligande. Slednje nakazuje na model aktivacije, kjer topen ligand sproži endocitozo in potem cepitev z γ-sekretazo v endosomu. Je pa točen mehanizem zaenkrat še nejasen. Predvideva se, da morda, sploh pri vezavi dimernih ligandov, pride od oligomerizacije receptorjev, ki inducirajo endocitozo. To so testirali z vnosom kemično inducibine homodimerizacijske domene DmrA v ogrodje SNIPR-receptorja. Zaznali so močno od liganda neodvisno aktivacijo, ko so dodali AP1903, ki stimulira oligomerizacijo prek homodimerizacijske domene DmrA [1].

Rak

Da bi dokazali, da SNIPR-receptorji lahko dejansko detektirajo endogene topne produkte in ne le mediju dodanih topnih ligandov, so zapis za SNIPR-receptorje vnesli v T-celice. Slednje so prenesli na vzorec kulture rakavih celičnih linij. Vnešeni SNIPR-receptorji so kot ligand zaznavali TGFβ, ki je značilen prodkut rakavih celic. Pri vezavi liganda pa se je sprožila transkripcija BFP. Aktivacija ekspresije BFP v TGF SNIPR T-celicah je v splošnem korelirala s produkcijo TGFβ1 v tumorskih celicah. To so potrdili s primerjavo meritev flurescence z rezultati, pridobljenimi s pomočjo metode ELISA (angl. enzyme-linked immunosorbent assay), ki omogoča zaznavo in kvantifikacijo proteinov. Pripravljene TGF SNIPR T-celice so testirali tudi in vivo s pomočjo mišjih modelov, ki so imeli vnešen tumor melanome. Glede na kontrolo, pri kateri so mišim vnesli samo običajne T-celice, je vnos TFG SNIPR T-celic znatno zmanjšal napredovanje tumorja. Receptorji topnih ligandov bi lahko izboljšali efektivnost CAR T-terapije, saj bi zagotovili bolj tarčno delovanje in specifičnost, če bi v CAR T-celice hkrati uvedli tako CAR, kot tudi SNIPR-receptor [1].

Zaključek

Zgradba SNIPR-receptorjev zadošča pogojem dobrega zaznavanja topnih ligandov. Iz tega razloga nam predstavljajo uporabno orodje za terapevtski bioinženiring, saj omogočajo zaznavo in lokalizacijo različnih bioloških aktivnosti. So prilagodljivi in jih lahko pripravimo za zaznavo različnih ligandov. Poleg zaznavanja in saniranja rakavih celic, bi potencialno lahko bili uporabni tudi za zaznavanje embrionalnega razvoja, avtoimunosti ali infekcije. Lahko pripomorejo tudi pri optimizaciji že obstoječih terapij, predvsem pri večji specifičnosti in efektivnosti delovanja CAR T-terapije [1].

Literatura

[1] D. I. Piraner et al., “Engineered receptors for soluble cellular communication and disease sensing,” Nature, vol. 638, no. 8051, pp. 805–813, 2025, doi: 10.1038/s41586-024-08366-0. [2] B. Khalil, E. J. Miller, and S. L. Lappin, “Physiology, Cellular Receptors,” in StatPearls, Treasure Island (FL): StatPearls Publishing, 2025. Accessed: Apr. 15, 2025. [Online]. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK554403/ [3] “CAR T Cells: Engineering Immune Cells to Treat Cancer - NCI.” Accessed: Apr. 15, 2025. [Online]. Available: https://www.cancer.gov/about-cancer/treatment/research/car-t-cells [4] D. VanDyke, W. Wang, and J. B. Spangler, “Innovative synthetic signaling technologies for immunotherapy,” Current Opinion in Biomedical Engineering, vol. 16, pp. 1–8, Dec. 2020, doi: 10.1016/j.cobme.2020.05.007. [5] B. Zhou et al., “Notch signaling pathway: architecture, disease, and therapeutics,” Sig Transduct Target Ther, vol. 7, no. 1, pp. 1–33, Mar. 2022, doi: 10.1038/s41392-022-00934-y. [6] I. Zhu et al., “Modular Design of Synthetic Receptors for Programmed Gene Regulation in Cell Therapies,” Cell, vol. 185, no. 8, pp. 1431-1443.e16, Apr. 2022, doi: 10.1016/j.cell.2022.03.023. [7] O. Quintero-Monzon et al., “Dissociation between Processivity and Total Activity of γ-Secretase: Implications for the Mechanism of Alzheimer-Causing Presenilin Mutations,” Biochemistry, vol. 50, no. 42, pp. 9023–9035, Oct. 2011, doi: 10.1021/bi2007146.