Popravljanje z izcepom nukleotida

Popravljanje z izrezom nukleotida (ang. Nucleotide excision repair oz. NER) je večstopenjski popravljalni mehanizem DNA, ki prepozna in odstrani širok nabor raznoterih poškodb na DNA, ki destabilizirajo dsDNA. V osnovi delimo proces na GG-NER (global genome NER), ki je odgovoren za iskanje ter odpravljanje poškodb po celotnem genomu, ter TC-NER (transcription-coupled NER), ki je sklopljen s transkripcijo in se tako izvede ob zaznavi poškodbe med samo transkripcijo. Sosledje dogodkov, ki sestavljajo NER, vključuje:

• zaznavo poškodbe in njeno potrditev;
• cepitev dveh fosfodiesterskih vezi (na 5' ter 3' koncu) poškodovane verige;
• izrez nastalega fragmenta, ki vsebuje poškodovani del;
• sintezo nove ssDNA (komplementarne glede na nepoškodovano matrično verigo) na mestu poškodbe;
• lepljenje koncev novonastalega oligonukleotida.

Poškodbe DNA

NER je edinstven popravljalni mehanizem zaradi sposobnosti poprave poškodb, ki so lahko posledica zelo različnih fizikalno-kemijskih dejavnikov. Ti vključujejo: UV-radiacijske poškodbe DNA, med katerimi sta najpomembnejša ciklobutanski pirimidinski dimeri (CPD) ter fotoprodukt (6-4) (6-4PP), adukte s številnimi kemičnimi sredstvi (cisplatin, psoralen, alfatoksini, benzo[a]piren, drugi policiklični karcinogeni,…), z oksidativnim stresom povezane poškodbe (npr. tvorba ciklopurinov) ter nekatere poškodbe, ki so posledica ionizirajočih sevanj. NER predstavlja pri višjih sesalcih (vključujoč človeka) edini mehanizem, ki je zmožen popraviti UV-radiacijske poškodbe (CPD, 6-4PP,…)! Da lahko NER v začetni fazi učinkovito zazna vse te različne poškodbe, se je sistem uravnal na skupno lastnost, ki združuje vse poškodbe, ki so posledica delovanja zgoraj naštetih sredstev. Vse poškodbe namreč povzročijo motnjo v povezovanju komplementarnih verig DNA oz. destabilizacijo Watson-Crickovih baznih parov, kar povzroča strukturno spremembo DNA na mestu poškodbe in njeni bližnji okolici. Zaradi oslabljenega povezovanja s komplementarno verigo postanejo baze bolj "ohlapne" (tako okvarjene, predvsem pa "zdrave" na komplementarni verigi!) in tako bolj izpostavljene in dostopne za vezavo na proteine, ki ta destabilizirana območja iščejo.

Popravljanje z izrezom nukleotida ob transkripciji (TC-NER)

Napake zaradi CPD so manj izrazite, zato se lahko izognejo GG-NER, kljub temu pa onemogočajo replikacijo in transkripcijo. Ko RNA polimeraza II dospe do poškodovanega nukleotida, se zaustavi. Nanjo se vežeta proteina Cockaynovega sindroma CSB in CSA. CSB preoblikuje kromatin v bolj odprto obliko s primerno konformacijo za popravilo. Taka RNA polimeraza II z dodatnimi proteini pokriva območje okrog 35 nukleotidov in s tem zakriva poškodovani nukleotid. Običajno se kompleks premakne nazaj in tako razkrije poškodovano mesto, kjer poteče izrezovanje.

Sklopitev GG-NER in TC-NER

Vezan XPC oz. CSB omogoča asociacijo kompleksa TFIIH (transkripcijski iniciacijski faktor IIH). Podenoti kompleksa sta helikazi XPB in XPD, ki se vežeta na DNA tik ob poškodovanem nukleotidu, verigo odvijeta ter še bolj razpreta. XPD služi tudi kot sekundarna potrditev lezije, saj vsebuje kanal, skozi katerega lahko teče le nepoškodovana ssDNA, ko pa naleti na poškodbo, se tik ob njej zaustavi. Če XPD poškodbe ne najde, celoten kompleks za popravljanje z izrezom nukleotida razpade in popravljanje se prekliče.
Na poškodovan nukleotid se z motivom cinkovega prsta na 5' veže XPA, ki prav tako služi potrditvi spremembe nukleotida, poleg tega pa sodeluje kot osrednji povezovalni člen in organizator kompleksa popravljanja.
Sedaj nepoškodovano ssDNA prepozna in se nanjo veže več molekul RPA (replikacijski protein A). Sledi ireverzibilna stopnja izreza nukleotidov, ki se mora izvršiti do konca, da ne bi prišlo do še hujših modifikacij DNA. RPA v sodelovanju z XPA uravnava vezavo endonukleaze XPF-ERCC1 na mesto 5' ssDNA, na mesto 3' pa endonukleazo XPG. Najprej se prekine veriga na 5' koncu, kjer se lahko takoj začne sinteza ustreznega komplementarnega dela, nato pa se prekine še del na 3' koncu; skupaj (nesimetrično glede na poškodbo) 22-30 nukleotidov dolg odsek ssDNA, ki prosto oddisociira z mesta poškodbe.
Ustrezna DNA polimeraza zapolni nastalo vrzel; kot začetni nukleotid uporabi kar 3' konec stare verige, zadnjo vez na novem 5' koncu pa vzpostavi še DNA ligaza. Po ustreznem popravilu se na ta odsek vežejo novi histoni, okrog katerih se ovije popravljena dsDNA.

Vpliv na celični cikel

Celični cikel mora biti uravnan tako, da ne pride do replikacije med popravljanjem poškodb. ATR (z ATM povezan protein) se aktivira zaradi povezave z RPA, ki asociira z ssDNA. Aktiviran ATR sproži kaskado, ki ustavi celico v fazi G₁ ali G₂. S tem NER pridobi več časa za dokončanje popravila. Če so poškodbe preobširne, p53 sproži apoptozo. V primeru, ko RNA polimeraza zaobide poškodbo, pride do nepravilnega prevajanja in mutageneze.

Popravljanje z izrezom nukleotida v prokariontih

Prokariontski sistem temelji na zgolj štirih encimih. Kompleks UvrA₂B ima helikazno aktivnost in išče morebitne poškodbe. Ko naleti na spremembo konformacije, nanj asociira UvrC. Podenota UvrC je sposobna izreza oligonukleotida, na katerega prost 3' konec se veže UvrD in ga odstrani. Vrzel se nato zapolni.
Če pride ob transkripciji do zastanka RNA polimeraze, se nanjo veže TRCF (povezovalni faktor popravljanja med transkripcijo) in polimerazo pomakne nekoliko proč od mesta poškodbe, nato pa pritegne UvrA₂, ki asociira z UvrB; prokariotnska procesa sta tako podobno sklopljena kot evkariontska.

Viri

• Marteijn, J. A., Lans, H., Vermeulen, W., Hoeijmakers, J. H. J. Understanding nucleotide excision repair and its roles in cancer and ageing. Nature Reviews: Molecular Cell Biology, vol. 15, 2016, str. 465-481.
• Costa, R. M. A., Chiganças, V., Galhardo, R. S., Carvalho, H., Menck, C. F. M. The eukaryotic nucleotide excision repair pathway. Biochimie, vol. 85, 2003, str. 1083–1099.
• Truglio, J. J., Croteau, D. L., Houten, B. V., Caroline Kisker, C. Prokaryotic Nucleotide Excision Repair: The UvrABC System. Chemical Reviews, vol. 106, št. 2, 2006, str. 233-252.