Robusten oscilator sinteznih genov z različnimi nastavitvami periode

A fast, robust and tunable synthetic gene oscillator

Ker je področje sintezne biologije relativno mlado, so za temeljna znanja in razvoj inženirskih osnov, ki omogočajo gradnjo kompleksnejših vezij, nujne raziskave pristopov konstruiranja [1]. S tem namenom so raziskovalci z univerze v San Diegu iz enostavnih bioloških naprav z uporabo povratnih zank pripravili izboljšani tip oscilatorskega biološkega sistema. Tak generator impulzov odlikuje robustnost in različne možnosti nastavitev periode izražanja reporterskega proteina. Rezultate svojih raziskav so predpostavili z računalniškim modelom, ki so ga kasneje preverili z uporabo večih laboratorijskih tehnik. Osredotočili so se predvsem na vpliv sprememb v pogojih gojenja bakterij in vpliv koncentracije induktorjev na lastnosti oscilatorskega sistema.

Uvod

Oblikovanje biološkega sistema

Najprej so raziskovalci načrtali vse biološke dele in naprave, ki sestavljajo preiskovani biološki sistem. Pri načrtovanju vezja so uporabili hibridni promotor plac/ara-1, ki ga je opisal Lutz s sodelavci [3]. Sestavljen je iz operatorske regije arabinoznega operona (araI1 in araI2) in laktoznega operona (O1 in Os). Razdalje med operatorskimi zaporedji in mestom začetka podvojevanja so ohranili. To promotorsko zaporedje so uporabili v treh transkripcijskih modulih. Prvi je bil generator aktivatorskega proteina AraC, drugi generator represorskega proteina LacI, tretji pa generator mutirane oblike GFP. Vsem trem zapisom za proteine so na karboksilni konec dodali oznako ssrA z zaporedjem TSAANDENYALAA (TS – tvori restrikcijsko mesto SpeI) [1]. Zaporedje označeno s krepkim tiskom je prepoznavno zaporedje prokariontske endopeptidaze ClpXP. Ta oznaka omogoča hitrejšo razgradnjo (t1/2 = 10 min) in s tem poveča dinamiko sistema. Vsem zapisom za proteine so zamenjali določene nukleotide in s tem zagotovili pravilno izražanje v bakterijah E. coli. V zapis za GFP so vstavili eno ključno mutacijo (A206K), ki preprečuje dimerizacijo omenjenega proteina. Za dimerno obliko proteina je znano, da lahko pri visokih ravneh izražanja škoduje celicam. Modificirane gene so nato vstavili v vektorje. Promotorsko zaporedje, mesto RBS in terminatorsko zaporedje je v vseh treh modulih enako. Aktivatorski modul in modul, ki generira GFP, so vstavili v plazmid pJS167. Plazmid nosi rezistenco na kanamicin. Plazmid pJS169, v katerega so vstavili represorski modul, nosi selekcijski marker za ampicilin. Aktivatorski/reporterski vektor ima mesto ori CoIE1 in se v celici pojavlja v večjem številu kopij kot represorski vektor, ki nosi ori p15A. V ustrezne bakterije E. coli so vstavili pripravljene vektorje.

Modeliranje

Modeliranje je uporaben pristop k snovanju kompleksnejših bioloških vezij, s katerim lahko napovemo njihovo obnašanje in vivo. Prvi model za oscilator sinteznih genov sklopljen z intrinzičnimi procesi v celici se je osredotočal predvsem na moč signala oscilacije ter njegovo povezovanje s celico [2]. Z diferencialnimi enačbami so opisali naraščanje in padanje signala pri ozko določenih vrednostih koncentracij induktorjev ter pogojev gojenja. Kasneje so ugotovili, da omenjeni model slabo razlaga dve področji eksperimentov. Zaradi natančno določenih pogojev in vrednosti koncentracij induktorjev ne moremo opazovati funkcijske odvisnosti periode od koncentracij induktorjev. Prav tako z danim modelom iz istega razloga ne moremo opisati robustnosti pripravljenega oscilatorja sinteznih genov. Prvi model je tako obsegal le del obnašanja izboljšanega oscilatorskega sistema v celicah [1]. Zato so raziskovalci predpostavili nov model, ki zavzema več različnih pogojev in koncentracij induktorjev ter natančneje opisuje vezavo med proteini in DNA, multimerizacijo proteinov, proces translacije in zvitja ter nastanek zank DNA. Upoštevanje popravkov je prispevalo k natančnosti modela, kar so potrdili s testiranjem. Predpostavili so tudi obnašanje sistema pod vplivom pozitivne in negativne povratne zanke, ki ju izboljšani oscilator vsebuje. Tik pred pojavom signala fluorescence naraste količina prepisane mRNA. S kratko zakasnitvijo, ki je posledica translacije in zvijanja proteinov, naraste sprva količina aktivatorja, nato pa količina represorja. Model predpostavlja enako hitrost transkripcije in translacije monomerov. Funkcionalna oblika represorja nastaja počasneje, ker je zapis zanj na plazmidu, ki je v celici prisoten v manjšem številu kopij. Poleg tega je represorski protein tetramer. Za njegov nastanek se porabi dvakrat več monomerov kot za aktivatorski protein, ki nastopa kot dimer.

Metode in tehnike

Za opazovanje delovanja bioloških sistemov in testiranje modelov so bili sintezni biologi primorani iznajti nove metode in tehnike opazovanja ter kvantificiranja signalov, ki so jih pridobili iz celic z vstavljenimi vezji. Raziskovalci so omenjeni sistem sprva okarakterizirali z metodo pretočne citometrije [1]. S tem so preverili delovanje sistema. Ker pa ta metoda omogoča le enkratno opazovanje celic, so uporabili izpeljanko mikrokemostata Tesla, ki sta ga za raziskovanje Saccharomices cerevisiae razvila Bennett in Hasty [4]. Uporabili so mikrofluidno napravo, ki je omogočala rast celic v eni plasti, pri čemer je bil dotok hranil stalen. To napravo so sklopili z metodo za opazovanje celic in merjenje fluorescence [1]. Kemostat Tesla so optimizirali tako, da so spremenili dimenzije kanalov in s tem omogočili konstanten dotok hranil. V vdolbino za rast celic so uvedli tri ploščate kanale, da so lahko opazovali tri enoplastne kolonije celic naenkrat. Sistem kanalov za pretok hranil in rast celic je v mikrofluidni napravi postavljen med dve površini, ki vzdržujeta konstantno temperaturo gojenja. Naprava vsebuje tudi učinkovit odvodni sistem, ki zagotavlja, da se kanali ne mašijo in je pretok stalen. Celicam so izmerili fluorescenco in jih posneli z mikroskopom. Za posnetke so uporabili tehniko časovnega zamika.

Rezultati

Opisano biološko vezje deluje preko povratnih zank. Aktivatorski homodimer proteina AraC se v prisotnosti arabinoze ne veže na operatorsko regijo promotorja. Ker zanka DNA ni več prisotna, se RNA polimeraza lahko veže na promotorsko zaporedje in sproži transkripcijo. Nasproten učinek ima represorski protein LacI, ki se kot homotetramer v odsotnosti IPTG (izopropil-β-D-1-tiogalaktopiranozid) veže na operatosko regijo promotorja in povzroči nastanek zanke DNA, ki preprečuje vezavo RNA polimeraze na promotor. Stalne oscilacije so posledica povratnih zank. Po dodatku arabinoze in IPTG se začne transkripcija vseh treh proteinov. Zaradi AraC se sproži pozitivna povratna zanka, ki še poveča aktivnost promotorja. Z zakasnitvijo se poveča še koncentracija LacI, ki sproži negativno povratno zanko, ki hitro in učinkovita zniža aktivnost promotorja. Sosledje sprememb koncentracij aktivatorja in represorja zaznamo kot oscilator [1].

Raziskovalci so pripravili izbrane modificirane zapise za proteine in jih vstavili v opisane plazmide. Z njimi so nato transformirali omenjene seve bakterij E. coli. Najprej so ob prisotnosti 0,7% arabinoze in 2mM IPTG s pretočno citometrijo opazovali fluorescenco celic v časovnih presledkih. Ugotovili so, da je več kot 99% celic izkazalo močne oscilacije fluorescence s periodo 40 minut. Oscilacija je potekala ves čas opazovanja (4 ure). Meritve fluorescence z mikrofluidno napravo so pokazala, da je faza oscilacije posredovana hčerinskim celicam, ki izhajajo iz iste kolonije. To obnašanje pa je bilo zaradi fazne difuzije opaženo le nekaj period [1].

Biološki sistem se je izkazal za zelo robustnega. Raziskovali so predvsem vpliv koncentracije IPTG in arabinoze ter vpliv temperature, vrste gojišča in časa podvojevanja celic. Spremembe v koncentraciji dodanega IPTG so omogočale različne nastavitve periode oscilacije. Nastavljivost periode je bila možna predvsem pri nizkih koncentracijah IPTG. Po pričakovanjih se perioda daljša linearno s koncentracijo IPTG. Pri koncentracijah IPTG, ki so večje od 5 mM, začne le ta interferirati z aktivacijo proteina AraC. Čas podvojevanja celic je tekom poskusov ostal približno enak. Koncentracija arabinoze ima podoben vpliv na periodo. Perioda se daljša z naraščajočo koncentracijo arabinoze do nasičenja sistema. Ko so spreminjali temperaturo gojenja, so ugotovili, da je perioda krajša, ko je temperatura višja. V tem primeru se je pričakovano zmanjšal tudi čas podvojevanja celic [1]. Z variiranjem komponent medija gojenja so dokazali, da je perioda oscilacije ni direktno povezana s celičnim ciklom.

V izboljšanem modelu so raziskovalci odkrili še eno do sedaj neznano lastnost oscilatorjev sinteznih genov. Predpostavili so, da bi kot oscilator delovalo tudi biološko vezje, ki bi bilo konstantno aktivno in bi vsebovalo le negativno povratno zanko, ki bi potekla z zakasnitvijo. Ta zakasnitev nastopi kot posledica translacije, zvitja in multimerizacije proteina LacI. Tak sistem so pripravili na podoben način kot opisanega. Odkrili so, da tak sistem izkazuje lastnosti oscilatorjev, vendar manj zanesljivo. Zaradi neodzivnosti na spremembe koncentracije IPTG sklepajo, da pozitivna povratna zanka služi tudi kot potenciometer biološkega oscilatorja [1].

Zaključek

Raziskovalci iz San Diega so pripravili biološko vezje, ki služi kot robusten oscilator z nastavljivo periodo. Ta sistem, ki je sestavljen iz treh bioloških modulov, so sprva načrtali in pripravili ustrezne modificirane biološke dele. Nato so z nadgradnjo obstoječega modela oscilatorja dokazali, da je v natančnem modelu izjemnega pomena upoštevanje vseh vmesnih stanj, kot so translacija, zvitje in multimerizacija proteinov ter njihova interakcija z DNA. Oscilator so pripravili, ga okarakterizirali in na njem testirali izboljšani model. S svojimi ugotovitvami so podprli model, ki je predvideval robusten in nastavljiv oscilatorski sistem. S svojo raziskavo so odprli nove možnosti gradnje bioloških vezij za regulacijo izražanja genov.

Viri in literatura

[1] Stricker J., Cookson S., Bennett M. R., Mather W. H., Tsimring L. S. in Hasty J. A fast, robust and tunable synthetic gene oscillator. Nature, 2008, letn. 456, str. 516-519.

[2] Hasty J., Dolnik M., Rottschäfer V. in Collins J. J. Synthetic gene network for entraining and amplifying cellular oscillations. Physical review letters, 2002, letn. 88, str. 148101-1-148101-4.

[3] Lutz R. in Bujard H. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements. Nucleic Acids Research, 1997, letn. 25, str. 1203-1210.

[4] Bennett M. R. in Hasty J. Microfluidic devices for measuring gene network dynamics in single cells. Nat Rev Genet., 2009, letn. 10, str. 628-638.