Slovo raku

http://2017.igem.org/Team:SDU_CHINA

NAMEN

Namen projekta je bil predstavitev novega načina imunoterapije za izkoreninjenje pobega imunskemu sistemu, ki se zgodi pri nedrobnoceličnem pljučnem raku (NSCLC). Uporabili so urejanje gena s pomočjo konstrukcije plazmida s sistemom Crispr-Cas9, ki cilja gene, ki kodirajo za ligand proteina programirane smrti (PD-L1). S tem bi inhibirali njegovo in situ izražanje in obnovili nadzor imunskega sistema nad tumorskimi celicami. Za varnost konstrukta so poskrbeli tako, da so konstruirali dodaten plazmid, s katerim so odstranili tako imenovane »housekeeping« gene obeh plazmidov. S projektom pričakujejo, da bodo dosegli daljše splošno preživetje, večjo učinkovitost in cenovno ugodnejši boj proti NSCLC.

UVOD

Pljučni rak je od vseh rakov najbolj pogost vzrok smrti pri ljudeh. Delimo ga na drobnocelični (SCLC) in nedrobnocelični pljučni rak (NSCLC). Zadnji je veliko bolj pogost in predstavlja kar 80-85% pacientov obolelih za pljučnim rakom. Nedrobnoceličnega raka histološko ločimo na žlezni, ploščatocelični in neopredeljen nedrobnocelični rak pljuč. V tej skupini so vrste raka, ki ga sestavljajo žlezne, ploščate ali pa velike celice. Je kronična in vnetna napredujoča bolezen z zapletenim mehanizmom. Za diagnosticiranje uporabljamo slikanje s CT-aparatom in odvzem tkiva. Najbolj pogosto uporabljena preiskava je bronhoskopija. Pri zdravljenju pljučnega raka se poslužujejo operacije, obsevanja in sistemskega zdravljenja. Najpogosteje najboljše rezultate prinese kombinacija terapij. Čeprav sta se kemo- in radiokemoterapiji hitro razvili prav tako kot tarčna zdravila, je prognoza pacienta z NSCLC še vedno neoptimistična, saj je njuna učinkovitost slaba ter doprineseta tudi številne škodljive stranske učinke. Terapija, ki je pridobila na priznavanju je imunoterapija. Razlog temu je uspeh pri blokiranju imunske kontrolne točke, ki je dala obetajoče klinične rezultate pri pacientih. Bistvo terapije je ciljanje kompleksa med proteinom za programirano smrt (PD-1) in ligandom (PD-L1) z uporabo protiteles.

PROTEIN ZA PROGRAMIRANO SMRT (PD-1) IN NJEGOV LIGAND (PD-L1)

PD-1 je ko-inhibitorski receptor, ki ima ključno vlogo pri pobegu imunskemu sistemu med širjenjem tumorja. Sestavljen je iz zunajcelične imunoglobulinu podobne vezavne domene, transmembranske regije in citoplazemske domene, ki vsebuje dva motiva, in sicer imunoreceptorski na tirozinu osnovani inhibitorni motiv (ITIM) in motiv imunoreceptorskega na tirozinu osnovanega stikala (ITSM). Oba motiva sta odgovorna za imunosupresivne učinke. PD-1 liganda PD-L1 in PD-L2 sta iz družine B7 in sta znana po prekomernem izražanju na površini tumorskih celic, kjer blokirata citotoksične T celice. PD-L1 se visoko izraža v mnogih imunskih, epitelijskih in tumorskih celicah. Številne študije so pokazale, da veliko število človeških tumorskih celic izraža PD-L1 molekule, kar omogoča njihovo uporabo za detekcijo in prognozo tumorja. Tumorske celice se vežejo na PD-1 na površini T celic in prenašajo negativne regulatorne signale preko ekspresije PD-L1 molekul, kar vodi k tumor specifični apoptozi in imunski nesposobnosti. Vmešavanje v transdukcijski signal PD-L1 in PD-1 s protitelesno blokado izboljša delovanje T celic s tem, da poveča signal transdukcije iz signalosoma receptorja T celic. Poznanih je več od PD-1 odvisnih inhibitornih mehanizmov, in sicer:

• Neposredni inhibitorni mehanizmi preko TCR signalosoma – odvisen je od SHP1 in SHP2 fosfataz, ki inhibirata aktivnost ZAP70 in PI3K. Prav tako se končajo mnoge intracelularne poti, ki potekajo navzdol (ERK); • Posredni inhibitorni mehanizmi preko TCR signaliziranja in proliferacije T celic - prikazani so preko regulacije izražanja in aktivnosti CK2. Od PI3K odvisna signalna pot, ki aktivira CDK2 in inhibira SMAD3. Gre za aktivacijo AKT preko PIP3, kar vodi k nastanku ubikvitin ligaze SCFm ki razgradi Kip1, ki je inhibitor CDK2. Aktivirana CDK2 sproži celičen cikel in inaktivira SMAD3 s fosforilacijo. Te poti negativno regulira PTEN fosfataza, ki razgradi PIP3. Med aktivacijo TCR, CK2 fosforilira PTEN in zmanjša svojo aktivnost. S PD-1 se izražanje in aktivnost CK2 zmanjšata, kar povzroči aktivnost PTEN, ki odstrani PIP3 in s tem onemogoči aktivacijo AKT; • Regulacija površinskega izražanja TCR s pomočjo PD-1 – PD-1spodbuja izražanje E3 ubikvitin ligaze iz družine CBL. Te ubikvitin ligaze ubikvitinirajo verige TCR in PI3K, kar vodi k odstranitvi TCR-jev iz površine T celic, najverjetneje z endocitozo. Zaradi tega T celice ne morejo odgovoriti na antigensko stimulacijo; • Metabolna kontrola s PD-1 – PD-1 spremeni metabolizem T celic iz glikolize v beta-oksidacijo z inhibicijo aktivnosti ERK in PI3K-AKT. S PD-1 stimulirane T celice bi tako metabolično spominjale na dolgo živeče spominske T celice.

KONSTRUKCIJA PLAZMIDOV

Torej, namen projekta je bil konstrukcija dveh plazmidov, katerih osnova je CRISPR tehnika. Z njima bi uspešno cepili gen za PD-L1 v rakavih celicah, hkrati pa bi bila njuna uporaba varna za normalne celice. Specifičnost in občutljivost so dosegli s pomočjo sgRNA in tumor specifičnih genov. sgRNA je sposobna pripeljati plazmide na pravo mesto cepitve, tumor specifičnni promotorji pa omogočajo izražanje cas9 na pravem mestu in ob pravem času. Posebnost oziroma specifičnost projekta je samomor prenesenih plazmidov ob odstranitvi gena za PD-L1. Torej, čeprav so plazmidi preneseni v normalne celice, se bodo tam cepili in degradirali.

• Konstrukcija prvega plazmida za cepitev PD-L1 Ogrodje prvega plazmida je lentiCRISPR V2. Promotor U6 so uporabili za izražanje ciljanja PD-L1 s pomočjo gRNA1 in hTERT (človeška reverzna trankriptaza telomeraza) ali survivin promotorja, ki je vstavljen med genoma za gRNA1 in Cas9. Zadnjemu sledi tudi gen za rezistenco na tetramicin. Torej, gRNA1 je namenjena vodenju encima cas9 do cepitvenega mesta, hTERT ali survivin promotor pa sta tumor specifična promotorja, ki se lahko izražata le v tumorskih celicah. hTERT promotor deluje kot regulatorni element za antitumorske gene, saj spodbuja izražanje, ki je specifično za antitumorske gene navzdol od tumorskih celic. S tem prepreči poškodbo normalnih celic. Survivin promotor pa spada v družino inhibitorjev apoptoze, ki antagonizirajo indukcijo celične smrti. Za tumorske celice je značilno visoko izražanje survivina, s čimer je postal atraktivna tarča za farmakologijo.

• Konstrukcija drugega plazmida za samomor plazmidov Konstrukcija drugega plazmida je podobna konstrukciji prvega plazmida. Za aktiviranje cas9 in izražanje gRNA2 so uporabili represibilen promotor tetR. Na ta način lahko protein tetR, ki ga izraža prvi plazmid, zatre represibilen promotor. S tem je ob prisotnosti tetR onemogočeno izražanje cas9 in gRNA. gRNA2 je ustvarjen za ciljanje replikacijske regije dveh plazmidov ter za vodenje cas9 na cepitveno mesto na plazmidu, ki je uporabljen za samomor plazmidov.

• Skupno delovanje plazmidov

Ob transfekciji rakavih celic z obema konstruktoma, se prvi plazmid izraža, drugi pa ne, saj ga inhibira protein tetR. To je posledica specifičnosti hTERT in survivina v tumorskih celicah. Če sta bila oba plazmida transficirana v normalne celice, hTERT ali survivin ne delujeta, tetR se ne bo izražal, vendar pa bo tetR represibilen promotor sprožil izražanje Cas9 in gRNA2. Le-ta vodi cas9 k cepitvi replikacijskega območja obeh plazmidov, kar povzroči samomor plazmidov. S tem je zagotovljena varnost normalnih celic.

MODEL

Pri projektu uspeh genske terapije sloni na začetni učinkovitosti in občutljivosti tumor specifičnih promotorjev. Za analizo so si izbrali aktivator EGF, ki pozitivno vpliva na začetno učinkovitost hTERT promotorja ter inhibitor YM155, ki lahko inhibira survivin promotor. Z modelom so želeli preveriti vpliv različnih koncentracij aktivatorja EGF na hTERT promotor in različnih koncentracij inhibitorja YM155 na survivin. Regulatorni model so uspešno konstruirali na dveh rakavih celičnih linijah. Ugotovili pa so, da ima EGF boljši aktivacijski učinek na hTERT promotor na eni celični liniji, YM155 pa boljši inhibitorni učinek na survivin promotor pa na drugi liniji.

ZAKLJUČEK

Pri projektu so za ustvarjanje nove terapije za NSCLC uporabili Crispr-Cas9 tehniko za zmanjšanje izražanja PD-L1 na površini rakavih celic. S tem so omogočili prepoznavanje s strani T celic, kar ima za posledico obnovljeno imunoinhibicijo. S pomočjo konstruiranja dveh plazmidov so uspeli doseči varnost za normalne celice. Rezultati projekta so pokazali, da ciljanje PD-L1 z sgRNA dobro deluje, saj ga lahko učinkovito odstrani. S tem pa združujejo gensko terapijo z imunoinhibicijsko terapijo kar doprinese k novim načinom zdravljenja tumorja.

VIRI

[1] http://2017.igem.org/Team:SDU_CHINA (23. 11. 2017)

[2] http://www.klinika-golnik.si/dejavnost-bolnisnice/opis-bolezni-in-preiskav/25/ (23. 11. 2017)

[3] https://www.cancer.org/cancer/non-small-cell-lung-cancer/about.html (23. 11. 2017)