Oblikovanje prilagodljivega celičnega predelka

Povzeto po projektu iGEM skupine Cologne-Duesseldorf

(Jernej Vidmar)

Uvod

Skupina študentov iz Kölna in Düsseldorfa se je na sinteznobiološkem tekmovanju iGEM 2017 predstavila z umetno narejenim celičnim predelkom, katerega namen je ustvariti okolje v katerem poteka sinteza željenega produkta – v tem projektu so sintetizirali nootkaton.

Nootkaton je organska molekula, ki jo v naravi najdemo v lupini grenivke. Nootkaton ima insekticidne lastnosti [Zhu, 2001] – veže se na oktopaminske receptorje. To povzroči hiperaktivacijo, insekti pa se začnejo tresti do smrti, ki nastopi v nekaj sekundah. Nootkatone je prehramben dodatek odobren s strani FDA, tako da je za človeka neškodljiv, za razliko od nekaterih drugih insekticidov pa komarji nanj še niso razvili odpornosti. Pri pridobivanju nootkatona se pojavljata dve težavi. Prva je zelo majhna koncentracija nootkatona v lupini grenivke – za izolacijo enega grama produkta je potrebno več sto kilogramov grenivk. Druga težava pa se pojavi pri sintezi nootkatona v kvasovkah Saccharomyces cerevisiae – zaradi toksičnosti sintezne poti nootkatona je končni izkoristek nizek.

Namen projekta, predstavljenega na iGEM 2017 je bil priprava modificiranega peroksisoma, v katerem poteka celotna sintezna pot nootkatona.

Peroksisom

Peroksisom ima dve poti uvoza proteinov in sicer preko proteinov Pex5 in Pex7. Pot preko proteina Pex5 je prevladujoča. Pex5 prepozna zaporedje C-konca proteinov (PTS1 - angl. peroxisome target signal), ki je evolucijsko zelo dobro ohranjeno. Z mutacijo nekaterih aminokislin na TRP regiji proteina so želeli spremeniti prepoznavni žep, ki bi tako prepoznal PTS1 zaporedje, ki se v naravi ne pojavlja (PTS1*).

Preko Pex7 se v peroksisom translocirajo proteini, ki imajo na N-koncu PTS2 signalno zaporedje, pri kvasovkah je to le 3-oksoacil-CoA tiolaza. Pex7 deluje kot citosolni šaperon, ki prepozna PTS2 in protein s tem zaporedjem prenese na peroksisomalno poro na membrani peroksisoma. Z modificiranjem te poti transporta proteinov, lahko skupaj z modifikacijo Pex5 poti nadziramo koncentracijo različnih proteinov, ki jih želimo v peroksisomu.

Membrana peroksisoma

Učinkovitost reakcije je lahko odvisna od različnih pogojev kot sta npr. pH in prisotnost ustreznih kofaktorjev. Za integracijo proteinov na membrano peroksisoma sta znani dve poti, in sicer, od Pex19/Pex3 odvisna in od endoplazemskega retikuluma odvisna pot, za obe pa je potreben mPTS signal. Pri tem projektu so želeli preizkusiti integracijo bakteriorodopsina na peroksisomsko membrano, saj bi s tem lahko uravnavali pH v peroksisomu.

Velikost in število peroksisomov

Proizvodnja in velikost peroksisomov je posledica različnih poti. Lahko nastanejo de novo preko brstenja iz endoplazemskega retikuluma, lahko pa nastanejo z delitvijo že obstoječih peroksisomov, pri čemer uporabijo za nastanek proteine in lipide pakirane v vezikle. Velikost in število peroksisomov sta regulirana s peroksini, proteini, ki se integrirajo v membrano peroksisomov. Pri kvasovkah se pojavljajo peroksini Pex11, Pex30, Pex31, Pex32 in Pex34.

Peroksini Pex30, Pex31 in Pex32 negativno regulirajo nastanek in velikost peroksisomov. Delecija genov za te proteine je pokazala povečano tako število kot velikost peroksisomov, vendar pa se pri tem poveča tudi permeabilnost membrane, zato se pri tem projektu niso ukvarjali z njimi.

Peroksin Pex11 povzroča povečano deljenje peroksisomov. Pri deleciji gena za Pex11 se v celici nahaja majhno število velikih peroksisomov, pri povečanem izražanju tega gena pa pride do velikega števila majhnih peroksisomov.

Peroksin Pex34 pozitivno regulira rast in deljenje peroksisomov. Tako kot peroksini Pex30, Pex31 in Pex32 poveča permeabilnost membrane, vendar pa je ta efekt veliko manjši.

Izločanje

Izolacija željenih produktov je najdražja stopnja njihovega pridobivanja. Najlažji način izolacije biotehnološko pridobljenih snovi je centrifugiranje, zato je zelo priročno, če celice željen produkt izločijo v medij. Tu ga lahko enostavno pridobimo, saj se pri centrifugiranju nahaja v supernatantu. Pri peroksisomih ni poznane nobene poti sekrecije, zato so pri tem projektu želeli integrirati v-SNARE v membrano peroksisoma, ta pa bi nato interagiral s t-SNARE na celični membrani, kar bi povzročilo fuzijo peroksisoma s celično membrano in izločanje produkta v okolico.

Senzorji

Encimska aktivnost je odvisna od pogojev, predvsem pH. Kot pH senzor so uporabili pHlourin – različico GFP, ki ima pri eksitacijskem spektru dva vrhova – pri 395 nm in pri 475 nm. Pri kislejših pogojih je bolj izrazit vrh pri 475 nm. Za spremljanje redoks potenciala so uporabili roGFP2, s katerim so spremljali v kakšni obliki se nahaja glutation v peroksisomu. Reducirani roGFP2 ima ekscitacijski vrh pri 485 nm, oksidiran pa pri 405 nm.

Sinteza nootkatona

Sinteza nootkatona poteka iz prekurzorja farnesil pirofosfata. V prvem koraku encim valencen sintaza pretvori farnesil pirofosfat do valencena. V naslednji stopnji encim P450 BM3 pretvori valencen do nootkatola, nootkatona in drugih stranskih produktov. Sočasno izražanje alkoholne dehidrogenaze z valencen sintazo poveča proizvodnjo nootkatona, saj favorizira pretvorbo nootkatona iz nootkatola. Za industrijske potrebe je željena koncentracija končnega produkta okoli 1 g/L, vendar pa je pri kvasovkah to nemogoče doseči, saj je toksična koncentracija nootkatola in nootkatona že pri nekaj 100 mg/L.

Pri sestavljanju biokock so si pomagali z Dueberjevo kaseto. Uporabljene biokocke: Povezava1, Povezava2.

Rezultati

V celicah z izbitim genom za Pex5 so testirali, kje v celici se pojavi fluorescenca. Pri različici R19 Pex5 se je fluorescenca pojavila v peroksisomih, kjer je bil na C-koncu fluorescirajočega proteina mTurquois PTS1* signal, pri obeh negativnih kontrolah pa se fluorescenca tega proteina pojavlja v celotni celici. To so potrdili tudi s kolokalizacijo fluorescence z Pex13-mRuby2.

Z naključno mutagenezo petnajstih nukleotidov na PTS2 zaporedju so želeli določiti, katero zaporedje se najbolje veže na Pex7. Luciferazo so cepili na N- in C-konec. N-konec so v peroksisom prenesli preko Pex5, C-konec luciferaze pa preko Pex7. V periksosomalno membrano so morali vstaviti tudi luciferinski transporter. Boljše kot je bilo prepoznavno zaporedje PST2, večja je bila luminiscenca. Poleg tega so preizkusili tudi reakcijo nastanka violaceina, ki potrebuje tri encime – VioA, VioB in VioE. VioE je encim, ki pretvori zelen produkt prvih dveh reakcij, prodeoksiviolacein. Kolonije, ki so vsebovale wtVioE so bile temno zelene barve, kolonije z VioE, ki vsebuje divji tip PTS2 signalnega zaporedje, so bile svetlo zelene. Kolonije z mutiranim PTS2 pa so bile bele, če se je PTS2* bolje vezal na Pex7 kot PTS2.

Uspešno so pripravili fuzijski protein Pex3-bakteriorodopsin in ga integrirali v membrano peroksisoma - to so dokazali z Pex3-bakteriorodopsin-mRuby, ki je fluoresciral na istem mestu kot GFP-PTS1.

Sprva so za kontrolo števila in velikosti peroksisomov preizkusili Pex11, vendar so rezultati pokazali, da delecija gena za Pex11, divji tip in povečano izražanje gena za Pex11, ne vplivajo na fenotip peroksisomov v kvasovkah.

Izražanje proteina Pex34 pod vplivom močnega konstitutivnega promotorja je privedlo do sprememb v fenotipu peroksisomov. Več poskusov pod različnimi promotorji in pogoji je pokazalo, da pride do povečanja števila in velikosti peroksisomov v primerjavi z divjim tipom. V projektu so pripravili fuzijske proteine v-SNARE in membranskih proteinov na peroksisomu. Kot reporterski protein so uporabili beta-glukuronidazo s PTS1. Največji signal v supernatantu se pojavi pri fuzijskem proteinu v-SNARE-Pex15L, kjer se v-SNARE nahaja v neposredni bližini membrane peroksisoma.

Delovanje pHlourina so sprva testirali z izražanjem v citosol – njegovo obnašanje je bilo pričakovano. Nato so pHlourinu dodali PTS1. PTS1 me vpliva bistveno na delovanje tega senzorja. V peroksisomu so izmerili rahlo kisel pH.

roGFP2 so najprej testirali in vitro. Kasneje so ugotovili, da fuzijski partner PTS1 ne vpliva na delovanje roGFP2. Dobili so skoraj enak redoks potencial roGFP2 v citosolu in peroksisomu.

Za sintezo nootkatona so uporabili valencen sintazo iz Callitropsis nootkatensis, ki je zelo odporna na spremembe pH in temperature, vendar pa je relativno zelo počasna, zato so za njeno izražanje uporabili najmočnejši promotor iz Dueberjeve kasete. Z western blotom so potrdili koekspresijo valencen sintaze, BM3-P450 in ADH v citosolu in njihove fuzijske proteine s PTS1 v peroksisomu. Kot metodo za določanje končnega produkta so uporabili masno spektrometrijo, predlagali so tudi HPLC. Vrh, ki bi moral pripasti nootkatonu je pod mejo zaznave, kar je lahko posledica nizke koncentracije produkta in neučinkovite izolacije vzorca.

Viri

Zhu, B. C., Henderson, G., Chen, F., Maistrello, L. in Laine, R. A. "Nootkatone is a repellent for Formosan subterranean termite (Coptotermes formosanus)." Journal of Chemical Ecology, 2001, 27(3), str. 523-531.