Brezcelična detekcija proteaze za diagnozo zapostavljene tropske bolezni

Povzeto po projektu iGEM skupine iz Oxforda.

(Tjaša Bensa)

Uvod

Skupina študentov iz univerze Oxford si je za tekmovanje iGEM 2017 zamislila detekcijski sistem za odkrivanje prirojene Chagasove bolezni. Cilj je bilo narediti sistem, s katerim bi lahko odkrili Chagasovo bolezen tudi pri novorojenčkih, prav tako pa bi bil ta sistem prilagodljiv tudi za detekcijo drugih podobnih parazitov in patogenov.

Chagasova bolezen

Chagasova bolezen spada med zapostavljene tropske bolezni, do katerih prihaja v revnejših deželah in skupinah ljudi. Zanje je značilno, da jim svetovna javnost ne posveča pretirane pozornosti, v primerjavi z boleznimi oz. sindromi kot so AIDS, tuberkuloza in malarija. Bolezen se pojavlja v Latinski Ameriki in ocenjujejo, da je z njo okuženih nekje 7 milijonov ljudi. Zaradi večjega števila selitev pa so zaznali povečan porast primerov tudi v ZDA in številnih evropskih državah. Chagasovo bolezen povzroča Trypanosoma cruzi, na človeka (in ostale sesalce) pa jo največkrat prenesejo stenice iz poddružine Triatominae. Lahko pa se bolezen prenese tudi s krvnimi transfuzijami, presaditvami organov, okuženo hrano ali z matere na njen zarodek. Predvsem prenos bolezni iz matere na otroka ostaja velik problem, saj je razširjenost bolezni na nekaterih podeželskih območjih v Boliviji tudi 70,5 %. Na začetku je akutno obdobje lahko brez simptomov ali pa s pojavom vročine. Traja od nekaj tednov do nekaj mesecev. Sledi latentno obdobje, ki lahko traja več desetletij, v nekaterih primerih pa celo življenje. Pri 10-30 % bolnikov latentna faza napreduje v kronično fazo, kjer se pojavijo zapleti na srcu, živčevju in prebavilih. Trenutne diagnostične metode vključujejo mikroskopijo parazitov, verižno reakcijo s polimerazo (detekcija DNA T. cruzi) in razne serološke teste za detekcijo protiteles proti T. cruzi. Diagnoza na osnovi protiteles ni primerna za diagnosticiranje novorojenčkov, saj še nimajo popolnoma razvitega imunskega sistema in na njih zato ne smemo izvajati imunoloških testov. Novorojenčki, ki so že okuženi s prirojeno Chagasovo boleznijo, ostanejo v akutni fazi do 9 mesecev, v tem času pa še ne obstaja cenovno dostopna diagnostika. Trenutno zdravljenje poteka z benznidazolom in nifutimoksom, ki je učinkovito pri več kot 90% pacientov s prirojeno Chagasovo boleznijo, če so zdravljeni v prvem letu življenja.

Biomarker: proteaza cruzipain

Proteaza cruzipain je cisteinska proteaza, ki jo T. cruzi izloča v vseh fazah okužbe. Ker je parazit v visoki koncentraciji prisoten med akutno fazo, so tudi koncentracije proteaze cruzipain v krvi visoke in s tem je zaznavanje izvedljivo. Proteaza cruzipain je visoko specifična za T. cruzi in zmanjšuje verjetnost lažno pozitivnih rezultatov.

Sistem za detekcijo:

Sistem na osnovi DNA

Ekipa se je odločila, da bo uporabila represor, ki bo tako spremenjen, da se bo inaktiviral s cepitvijo s proteazo cruzipain. Izbrali so Tet represor (TetR), ki je močan represor. Sestavljen je iz dveh domen (dimerizacijska domena in DNA-vezavna domena), vmes pa je prisotna povezovalna regija, ki bi se jo dalo spremeniti tako, da bi ji dodali prepoznavno mesto za proteazo cruzipain. V primeru, da je proteaza cruzipain prisotna, pride do cepitve na povezovalni regiji TetR in posledično do sinteze proteaze TEV (proteaza iz virusnega tobačnega mozaika). Proteaza TEV je dobro okarakterizirana, zelo specifična in se lahko izraža v preprostih bakterijskih sistemih, kar je idealno za testiranje senzorjev. Proteaza TEV v nadaljevanju cepi sterično oviran bivalirudin in prepreči strjevanje krvi. Zaradi nevarnosti dela v laboratoriju s proteinom, ki izhaja iz patogenega organizma, so tudi pri načrtovanju uporabili proteazo TEV. Tako so v povezovalni regiji na TetR načrtovali prepoznavno mesto za proteazo TEV. Sestavili so več delov:

- BBa_K2450101: proteaza TEV z oznako mCherry; za konstantno raven izražanja proteaze TEV.

- BBa_K2450201: TetR s cepitvenim mestom za proteazo TEV in CFP oznako.

- BBa_K2450251: TetR s CFP oznako; kontrola.

- BBa_K2450301: promotor pTet in eYFP: za testiranje učinkovitosti modificiranega represorja Tet, gre za srednje močan pTet promotor. Ta del je bil predvsem pomemben zato, da so imeli primerno razmerje med lažno negativnimi in lažno pozitivnimi rezultati. TetR se kot dimer veže na pTet, razen ob prisotnosti tetraciklina. Ker je TetR močan represor, je puščanje promotorja redko. Prvi del je zajemal testiranje, ali se TetR res veže na pTet in zavira sintezo eYFP. Po tem je sledil drugi del, kjer so preverjali, ali tetraciklin sprosti TetR inhibicijo in po pozitivnih rezultatih dokazali, da je TetR res komponenta, ki represira.

Za optimizacijo in potrditev vseh delov, so si zamislili več konstruktov plazmidov in eksperimentov, s katerimi bi potrdili uporabnost in natančnost izvedbe. Vsi načrtovani konstrukti plazmidov jim niso uspeli, so pa pokazali, da je se proteaza TEV z oznako mCherry sintetizirala. Prav tako je bil del pTet-eYFP statistično občutljiv na TetR represijo.

Sistem na osnovi proteinov

Ekipa je uporabila razdeljeno proteazo TEV, kjer sta dve polovici proteina prisotni ločeno v nepovezani, torej neaktivni obliki. Vsaka polovica je povezana s svojim dimerizacijskim proteinom in ko pride do dimerizacije, postane proteaza TEV aktivna. N-končni fragment razdeljene proteaze TEV je bil povezan s proteinom z levcinsko zadrgo A. A del je bil povezan z inhibitornim proteinom B*, med katerima je bila povezovalna regija s prepoznavnim zaporedjem za proteazo cruzipain. C-končni fragment razdeljene proteaze TEV je bil povezan s proteinom z levcinsko zadrgo B. Do aktivacije proteaze TEV je prišlo, ko je proteaza cruzipain cepila vmesni del med A in B* in sta levcinski zadrgi A in B lahko dimerizirali. Predpostavili so, da bi z uvedbo pozitivne povratne zanke lahko povečali signal, prav tako pa bi se tudi skrajšal čas, potreben za sintezo dovoljšnega izhodnega signala za detekcijo. Naredili so sistem, kjer lahko tako proteaza TEV, kot tudi proteaza cruzipain cepita povezovalno regijo med A in B*, kar posledično vodi v povečan izhodni signal. Da so se izognili procesu liofilizacije proteinov, so uporabili vezikle zunanje membrane (OMV, angl. outer membrane vesicles). To so lipidni vezikli, ki vsebujejo periplazmo in proteine, izločajo pa jih vse gram negativne bakterije. Nekatere raziskave so pokazale, da je encimska funkcija encimov v OMV lahko ohranjena med procesi liofilizacije. Tako je bil cilj skupine željene proteine usmeriti v bakterijsko zunanjo membrano, izolirati vezikle, ki vsebujejo proteine, jih liofilizirati za shranjevanje in transport in nato raztopiti (ob dodatku krvi) ter lizirati OMV. Pri tem so uporabili protein OmpA, ki se nahaja na zunanji membrani bakterijske celice in se z veliko hitrostjo transportira v vezikle. Nanj so pripeli protein SpyTag. Na N-končni fragment razdeljene proteaze TEV pa so pripeli protein SpyCatcher s signalnim zaporedjem TorA, ki je vodilo v periplazmo. Tu je prišlo do vezave SpyCatcher (Lys31) in SpyTag (Asp117) ter nastanka vezikla, ki je vseboval N-končni fragment razdeljene proteaze TEV. Ta kompleks se je nato preko OmpA transportiral v vezikel.

Izhodni signal

Ker je bil sistem narejen na osnovi brezceličnega sistema, so iskali najpreprostejšo rešitev in našli hirudin, majhen antikoagulantni peptid, ki inhibira trombin. Pri eksperimentu so uporabili njegov inženirski analog bivalirudin, ki je bivalentni, visoko afinitetni reverzibilni inhibitor trombina. V obeh sistemih (na osnovi DNA in proteinov) so se odločili za sterično oviran bivalirudin. Ta bi vseboval cepitveno mesto za proteazo TEV. Ko bi bil sistem aktiviran, se kri okuženih pacientov ne bi mogla strjevati, saj bi bivalirudin deloval kot inhibitor trombina.

Načrtovanje

Zaradi lažjega in preprostejšega transporta kompleta za detekcijo, se je ekipa odločila za brezcelični sistem. Končni komplet za sistem na osnovi DNA bi vseboval celični lizat, proteazo TEV in TetR s specifičnim cepitvenim zaporedjem, ki bi se reakciji dodal kasneje. Vse skupaj bi bilo liofilizirano v jamici kompleta.

Za izhodni signal so izbrali sistem, ki bi temeljil na strjevanju krvi, merili pa bi s pomočjo mikrofluidike. Pri tem so poskušali komplet čim bolj poenostaviti in uporabili pretok skozi kapilarno cevko. Komplet bi vseboval Microsafe pipeto, za merjenje časa pa bi uporabili Time-strips. Najprej bi na zgornji del kompleta vstavili pipeto, ki bi vsebovala 30 µl vzorca krvi. Po 10-15 minutah bi levi in desni del kompleta združili in kri bi začela teči po kapilari. V kapilari so prisotni razni faktorji strjevanja, ki povzročijo, da se kri strdi (razen v primeru, da se aktivira bivalirudin). Če se po 10 minutah na koncu pojavi vzorec krvi, se kri v kapilari ni strdila in pacient je pozitiven na Chagasovo bolezen.

Zaključek

Ekipa študentov si je zamislila sistem, s katerim bi lahko odkrili Chagasovo bolezen tudi pri novorojenčkih. Zavedali so se, da je bil zamišljen projekt precej obširen in ga je v nekaj mesecih težko končati. Vseh željenih stvari tako niso uspeli dokončati/dokazati v takšni meri, kot bi si želeli. So pa imeli še precej idej, ki bi bile primerne za klinično preizkušanje v primeru, da bi se ta detekcijski sistem nekoč res uporabljal.

Viri

iGEM ekipa Oxford

Chagasova bolezen