Nov terapevtski pristop za ciljanje signalne poti Hippo

Novo strategijo zdravljenja rakavih obolenj predstavlja prekinitev interakcij med proteinoma signalne poti Hippo, YAP in TEAD, ki delujeta v jedru celice. Pri načrtovanju takšnih zdravil predstavlja izziv tarčna dostava zdravila v jedro celice. S tem bi dosegli povečanje terapevtskega in zmanjšanje stranskih učinkov [1].

V ta namen so raziskovalci pripravili trifunkcionalni terapevtski peptid, ki so ga sestavljali dostavni peptid (CPP, angl. »cell penetrating peptide«), signalno zaporedje za jedrno lokalizacijo (NLS) in interferenčni peptid, ki preprečuje interakcijo med YAP in TEAD [1].

Signalna pot Hippo

Signalna pot Hippo je bila odkrita v Drosophili melanogaster in je ohranjena v sesalcih. Nadzoruje celično proliferacijo in preživetje celic. Spremembe v izražanju številnih proteinov, ki jo sestavljajo, so bile povezane z nastankom različnih rakavih obolenj [1, 2].

Osrednji del signalne poti Hippo sestavlja protein Merlin (Mer), ki vpliva na aktivnost kinaze Mst1/2. Ta ob aktivaciji Hippo signalne poti s fosforilacijo aktivira kinaze Sav1, Mob1 in Lats1/2, slednja pa fosforilira kompleks YAP/TAZ, ki se ob tem premakne iz jedra v citoplazmo. Tam se lahko poveže z različnimi proteini, ki YAP/TAZ zgolj zadržijo v citoplazmi ali pa povzročijo njegovo razgradnjo. Signalna pot Hippo je aktivirana v normalnih celicah, saj tako preprečuje pretirano proliferacijo, vzdržuje tkivno homeostazo in ohranja normalno velikost organov [1, 2].

V kolikor do fosforilacije YAP/TAZ ne pride, je kompleks lokaliziran v jedru, kjer se poveže s proteinom TEAD. Skupaj delujeta kot transkripcijska faktorja antiapoptotičnih genov in genov, povezanih s celično proliferacijo. V številnih tipih rakavih obolenj je bila ugotovljena povečana ekspresija YAP, ki zaradi jedrne lokalizacije in vezave s proteinom TEAD spodbuja celično proliferacijo, onkogeno transformacijo in epitelijsko-mezenhimski prehod [1, 2].

Priprava in karakterizacija terapevtskega peptida

Priprava trifunkcionalnega peptida se je pričela z iskanjem interferenčnih peptidov, ki bi preprečili interakcijo YAP-TEAD. Na nitrocelulozno membrano je bil nanešen TEAD, izražen v obliki prekrivajočih se dodekapeptidov. Nato je bil dodan z GST označen YAP, ki je interagiral samo s tistimi peptidi, ki so ustrezali vezavnemu mestu za YAP na proteinu TEAD. Vezavno mesto so zaznali s pomočjo dodatka protiteles proti GST, označenih s peroksidazo. Vezavno mesto za YAP na proteinu TEAD obsega 18 aminokislin, ki so predstavljale zaporedje interferenčnega peptida TEAD. Sledila je njegova sinteza in in vitro preverjanje učinkovitosti preprečevanja tvorbe kompleksa YAP-TEAD. Z imunoprecipitacijo je bila potrjena uspešnost inhibicije interakcije med YAP in TEAD s peptidom TEAD [1].

Preprečevanje interakcije lahko poteče le v jedru celice, zato so morali raziskovalci pripraviti učinkovit dostavni sistem, sestavljen iz CPP in NLS. CPP so peptidi, sestavljeni iz pozitivno nabitih aminokislinskih ostankov, ki lahko vstopijo v celico. Izbrani CPP, Mut7DPT, je vseboval aminokislini lizin in triptofan, kar je povečalo njegovo odpornost na delovanje proteaz [1, 3]. Jedrna membrana predstavlja oviro za CPP, zato so tega povezali z bipartitnim NLS in tako omogočili jedrno lokalizacijo. Pripravljena sta bila dva dostavna sistema, poimenovana NLS18 in NLS23. Vsebovala sta 19-22 aminokislinskih ostankov, s čimer sta se izognila zaznavanju z MHC-II kompleksom [1].

Najprej so s pomočjo pretočne citometrije v celicah MDA-MB231 preverili toksičnost in lokalizacijo omenjenih dostavnih sistemov brez pripetega peptida TEAD. Viabilnost celic se v 4 urah po dodatku 25 ali 30 μM dostavnih sistemov ni zmanjšala glede na kontrolne celice. NLS23 se je v jedru lokaliziral že po 15 minutah inkubacije, NLS18 pa po 30 minutah [1].

Na NLS18 in NLS23 so pripeli peptid TEAD in tako pripravljenima terapevtskima peptidoma NLS18-TEAD in NLS23-TEAD določili toksičnost, subcelično lokalizacijo in občutljivost na delovanje proteaz. S FITC označena 25 μM terapevtska peptida nista bila toksična za celice, prav tako pa se je ob dodatku 15 μM peptidov ohranila jedrna lokalizacija. Analizo občutljivosti pripravljenih peptidov na razgradnjo s proteazami so izvedli s pomočjo masne spektrometrije. NLS18-TEAD in NLS23-TEAD so 6 ur inkubirali v človeškem serumu, pri čemer se je NLS18-TEAD izkazal za stabilnejšega od NLS23-TEAD [1].

Učinkovitost terapevtskega peptida

Za ovrednotenje apoptotskega učinka NLS18-TEAD in NLS23-TEAD so celice za 24 ur inkubirali s posameznim peptidom in določili apoptozo s pomočjo barvanja z barvilom Annexin V-FITC. Glede na kontrolne celice se je apoptoza celic, inkubiranih s 25 μM NLS18-TEAD ali NLS23-TEAD povečala za približno 63 %. Protitumorski učinek in vivo so ocenili s pomočjo mišk C3H/S, ki so jim injicirali celično linijo TN60-UNLP in tako pridobili ksenografski model raka dojke. 5 dni po injiciranju celic so raziskovalci pričeli z injiciranjem 5 mg/kg NLS18-TEAD, pri čemer je bilo opaženo 67 % zmanjšanje tumorjev glede na miške, ki terapije niso prejemale. V primeru injiciranja 5 mg/kg NLS23-TEAD do zmanjšanja tumorjev ni prišlo [1].

Zaključek

Opisani terapevtski pristop predstavlja nove možnosti razvoja protitumorskih zdravil, pripravljeni peptid pa obetajoče potencialno zdravilo za uravnavanje signalne poti Hippo.

Viri

[1] L. Dominguez-Berrocal, E. Cirri, X. Zhang, L. Andrini, G. H. Marin, S. Lebel-Binay, A. Rebollo: New therapeutic approach for targeting Hippo signalling pathway. Sci. Rep. 2019, 9(1), 4771.

[2] B. Zhao, L. Li, Q. Lei, K. Guan: The Hippo-YAP pathway in organ size control and tumorigenesis: an updated version. Genes Dev. 2010, (24), 862-874.

[3] X. Zhang, J. Y. Brossas, C. Parizot, J. M. Zini, A. Rebollo: Identification and characterization of novel enhanced cell penetrating peptides for anti-cancer cargo delivery. Oncotarget. 2017, 9(5), 5944-5957.