Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz

Restrikcijski encimi

Restrikcijski encimi ali restrikcijske endonukleaze  so encimi, ki so sposobni cepiti DNK v manjše fragmente. To storijo v bližini ali  znotraj specifičnega prepoznavnega zaporedja, ki se nahaja znotraj DNK molekule. To so restrikcijska mesta. 
Restrikcijske encime zdaj delimo na pet glavnih tipov, ki se med seboj razlikujejo v strukturi, ali cepijo znotraj restrikcijskega mesta ali pa izven, ter tudi  kateri kofaktorji so potrebni za delovanje. Restriktaze cepijo molekulo DNK , na po enem mestu na posamezni verigi dvojne vijačnice, tako da razcepijo fosfodiestrsko vez.

Do poimenovanja restrikcijski encim so prišli pri  proučevanju bakteriofagov λ v 60-ih prejšnega stoletja. V nadaljevanju bova predstavila pionirske članke, ki so privedli do odkritja teh izjemno pomembnih encimov.

(Bor Klančnik)

Od fagov do prvih 'E.coli restrikcijskih endonukleaz

Med prvima, ki sta opazoval bakterijske okužbe in pri tem naletela na fenomen restrikcije in modifikacije, sta bila G. Bertani in J.J. Weigle (članek objavljen 1952). Vendar takrat nista vedela na kaj sta naletela. Sama sta preučevala fagni razvoj v bakterijskih gostiteljicah in kako različni sevi bakterij vplivajo na sam sev virusa. V študiji sta uporabila različne seve bakterije E. coli (S, C, in nelizogeničen K-12 in derivate) in Sh sev S. dysenteriae ter faga λ in P2. Oba fag sta bila uspešno transformirana v prvih bakterijah. Pri ponovni okužbi s pridobljenimi novimi fagi, sta poskušala okužiti druge seve bakterij in pri tem ugotovila, da je to le malokrat uspešno. Pravilno sta predpostavila, da gre pri tem za lastnosti bakterij in ne samih fagov. Ker pojem restrikcije še nista poznala, sta to opisala kot preko gostitelja inducirana/kontrolirana variacija.

V letu 1962 je W. Aber objavil članek ,kjer je predlagal teorijo, ki bi razložila ta fenomen vpliva gostiteljskih bakterij na fagno DNK.  V raziskavi je uporabil 32P-označen fag λ K in opazoval razgradnjo označene DNK ob okužbi različnih sevov bakterij. Poleg označevanja pa je še uporabil metodo reševanja cepljenega genoma faga s superinfekcijo le tega v označene seve bakterij okužene z necepljenimi fagi. S slednjo je pokazal, da obstaja mehanizem znotraj gostiteljice, ki prepozna takšen fag in ga razgradi. V namigovanju , je opozoril, da obstaja možnost cepitve fagne DNK na točno določenih mestih. Vendar se tej teze, takrat še ni zagovarjal.

Kmalu za tem, v letu 1968, pa je prišlo do odkritja prvega restrikcijskega encima. M. Meselson in Robert Yuan sta kot prva izloirala (sicer istočasno kot Aber) in opisala restrikcijski encim iz E.coli. Do tedaj že dobro poznani sistem gostiteljsko kontroliranim modifikacij, je dobil nov pomen. Šlo je za encim, ki je sposoben razgraditi fagno DNK na določen fragmente.  Ugotovila sta, da ti restrikcijski encimi za popolno delovanje potrebujejo Mg+2 ione, ATP in S-adenozilmetionin (SAM). S serijo izvirnih in hkrati preprostih eksperimentov sta določila, da gre pri restrikcijskem encimu za endonukleazo (cepi samo znotraj zaporedja), nastali fragmenti DNK so dvoverižni in ne enoverižni ter da encim naprej cepi eno verigo in šele nato drugo. Nazadnje sta dokazal, da do cepitve heterodupleksov fagne DNK ne pride, kar pomeni da encim lahko cepi le določeno zaporedje. Uspešno sta izolirala encima iz bakterijskega seva K in iz P1 liziranih celice. Poimenovala sta ju E. coli endonukleza IIIK in IIIP. 

(Bor Klančnik)

Odkritje restriktaz v Hemophilus influenzea in določitev restrikcijskega mesta

Po odkritju prvih restrikcijskih endonukleaz, ki so jih izolirali iz E. coli, je Hamilton Smith poizkusil in uspel dokazati, da podobne restrikcijske endonukleaze obstajajo tudi v bakteriji Hemophilus influenzae, ki jih danes imenujemo kar endonukleaze R. V članku iz leta 1970 sta skupaj z K. W. Wilcoxom podrobno opisala postopke izolacije, čiščenja in . Izvlečke seva Rd iz H. influenzae, ki vsebujejo restrikcijske endonukleaze sta očistila do te mere, da ni bilo več mogoče zaznati exo- ali endonukleaznih aktivnosti.  Ker ima vsak organizem značilno specifično viskoznost DNK, sta za sledenje eksperimentom uporabila ravno to metodo. Opazila sta, da ko sta dodala nativno DNK od organizma iz katerega sta izolirala encim do sprememb v specifični viskoznosti ni prišlo. Medtem ko pa sta encimu dodajala tuje DNK, kot je recimo P22 DNK, je specifična viskoznost padla za približno 25%. S svojim eksperimentom sta dokazala, da endonukleaza prelomi DNK preko obeh vijačnic tako, da nastane 5’-fosforil, 3’-hidroksil cepitev in da se te cepitve zgodijo omejeno krat na tujih nativnih DNK. Poleg prej omenjene P22 DNK, sta testirala še fag T7, DNK od S. typhimurium, DNK iz sperme lososa in še nekatere druge, vendar pa sta pri vseh opazila degradacijo do podobne stopnje. Podobno kot endonukleaza izolirana iz E. coli tudi ta ne razcepi lastne nativne DNK ali tuje denaturirane. Danes vemo, da raziskovana endonukleaza R spada v skupino tipa 2 in da cepi točno pri ali zraven prepoznavnega zaporedja (restrikcijskega mesta). Prva vprašanja v to smer si je postavljal tudi Hamilton Smith, kar pa je nekoliko pozneje skupaj z Thomas J. Kellyjem tudi raziskal in potrdil.

Oba članka sta bila objavlena v isti izdaji Journal of Molecular Biology. Sekvenco restrikcijskega mesta sta določevala s pomočjo analize koncev fragmentov, ki jih je naredil encim. S tem sta določila, da je zaporedje ki ga prepozna encim GTY|RAC, kjer je Y = piridinska nukleinska kislina in R = purinska nukleinska kislina. Ker encim ne razgradi lastne DNK, sta predvidela dve možnosti, ali je dotična sekvenca na nek način modificirana, ali pa je v svojem DNK zapisu ne vsebuje. Pri tem ju je najbolj presenetila simetričnost restrikcijskega mesta. Predpostavila sta tudi dva mehanizma delovanja endonukleaze, pri prvem sta predlagala model, ko se le ena molekula encima veže na restrikcijsko mesto in medtem ko “zlomi” prvo verigo, takoj “napade” drugo komplementarno in razbije verigo podobno kot na prvi verigi. Kot drug model pa sta predstavila mehanizem, ko se dve podobni molekuli encima simetrično povežeta v tarčno zaporedje in dvojno vijačnico prelomita hkrati.

Po objavi teh člankov se niti sam Hamilton Smith ni zavedal pomembnosti svojega odkritja. Vendar pa je na podlagi njegovih raziskav le leto dni pozneje Daniel Nathans postavil temelje moderne biokemijie kot jo poznamo danes. Saj je lahko s tem, da je vedel kje točno cepi endonukleaza R, sestavil celotno fizično mapo simian virusa 40 (SV40) iz fragmentov, ki so nastali po obdelavi z encimom. S tem je pa uspel odkriti tudi začetno mesto replikacije in mesto SV40 genov. Nathans je izboljšal tudi postopek ločbe fragmentov saj sukrozni gradient, ki ga je uporabil Smith ni dal dovolj dobre resolucije. V tem času je ravno Ulrich Loening kot pionir začel izvajati elektroforezo na poliakrilnem gelu (PAGE), kar je dalo neprimerljivo boljšo ločbo. Ta tehnika je v uporabi v različnih izvedbah še danes. Nathans in njegova ekipa so zelo natančno napovedali potencialne aplikacije restrikcijskih endonukleaz, kot so: uporaba fragmentov za sestavo celotne fizične mape (to so tudi sami dokazali); lokalizacija začetka replikacije in pozicija genov (tudi to so dokazali sami na primeru SV40); posamezen gen bi lahko mapirali na tak način, da mu med transformacijo testiramu biološko aktivnost; priprava mutantov z delecijo specifičnih fragmentov.

(Alen Šadl)

Uporabnost restrikcijskih encimov

Hamilton O. Smith, Daniel Nathans in Werner Arber so leta 1978 za svoja odkritja restrikcijskih encimov in njihove aplikacije v molekularni genetiki prejeli Nobelovo nagrado v fiziologiji in medicini. 

Odkritje restrikcijskih endonukleaz je bila osnova za razvoj rekombinantne tehnologije. Encimi ki so sposobni cepiti na točno določenem mestu znotraj DNK, nam omogočajo manipulacijo genov in proizvodnjo proteinov v velikem obsegu (rekombinanten inzulin). Endonukleaza R in ostale iz skupine tipa 2 so izjemno pomembne v genetskem inženiringu, kjer se uporabljajo za kloniranje, tvorbo knjižnic, sekvenciranje DNK, detekcijo in preprodukcijo enzimov, hormonov in še česa. Uporabljamo jih tudi za DNK fingerprinting, tehnika s katero lahko lokaliziramo mutacije, detektiramo okvarjene gene, ugotavljamo sorodstvenost (testi očetovstva, kriminalna analitika,..)

Z ozirom na to, da danes v nobenem biokemijskem laboratoriju ni hladilnika, ki nebi vseboval endonukleacijskih restriktaz lahko mirne vesti trdimo, da so izjemno pomembne in da si danes dela v takem laboratoriju brez njih ne predstavljamo.