TrDNA-vaje-citati

Kaj bi to pomenilo?

Predstavljam izbor citatov iz starih poročil, ki (upam, da) govorijo sami zase. Mislim, da je najbolje, da citate predelate po tem, ko ste posamezno vajo že opravili.

Poskušajte ugotoviti, kaj je čudnega v navedenih izjavah!
Če vam ne uspe, me vprašajte na naslednjih vajah!

Naloga II (primerjava metod za izolacijo plazmidov)

• Izolirali smo super zvito DNA iz Escherichie coli.
• RNaza je bila premalo specifična, zato na gelu še vidimo ostanke RNA.
• LiCl ima nekakšno RNazno aktivnost.
• Pri dodatku LiCl nimamo nič superzvite DNA (zelo verjetno je prišlo do razgradnje le-te).
• Dodatek etidijevega bromida pred polimerizacijo ni vplival na dolžino poti plazmidov.
• Prisotnost etid. bromida poveča elektroforezno mobilnost plazmidne DNA.
• Na gelu z etid. bromidom vidimo še druge konformacije, ker je etid. bromid denaturant.
• Na 1% gelu so fragmenti lažje potovali kot na 2%.
• 1% gel je boljši, ker so lise bolj narazen, kar lažje detektiramo.
• V žepkih, kjer smo dokazovali delovanje RNaz, opazimo naslednje: /... / . Ob primerjavi žepka 1 in 4 opazimo, da je metoda s kuhanjem bolj primerna. V žepku 5 je vzorcu dodan LiCl, v žepku 7 pa CTAB.
• Prvi žepek služi kot kontrola, v drugem žepku je prisotna majhna količina RNaze, v tretjem pa večja. V prvem žepku vidimo prisotnost RNA (temna lisa, ki je pripotovala najdlje).
• Na prvo mesto v gelu RNaze nismo dodali, na drugo smo dodali majhno količino, na tretje pa največjo količino RNaze.
• Na gelu je jasno vidna kromosomska DNA v žepkih in RNA molekula, ki je v gelu pripotovala najdalj. Vendar pa ti dve molekuli ne kažeta na razliko med 1% in 2% agarozo.
• Vzorec 4 je bil pridobljen s kuhanjem brez dodatkov.
• Sklepamo lahko celo, da je v zgornji lisi prisotna na kupu vsa plazmidna DNA tik ob ostankih kromosomske DNA, tako da sta težko ločljivi.
• Vprašanje je, če bi nam daljši čas omogočil boljšo ločbo ali bi se DNA pomikala v enem velikem klobčiču.
• Kontrola je encimska liza brez dodatka.
• Najbolje bi bilo dati v vzorec zelo nizko koncentracijo RNaze pri krajši inkubaciji.
• RNA je bila precej fragmentirana.
• Bolje je, če dodamo manjšo koncentracijo RNaze.
• Intenzivnost lise RNA se zmanjša tudi ob dodatku CTAB, kar kaže na manjšo količino izolirane RNA, kar smo tudi pričakovali, saj CTAB v prisotnosti nizke koncentracije NaCl veže in obarja nukleinske kisline.
• Pri nanosih 5, 6 in 7 smo izolaciji s kuhanjem dodali v vsak nanos še enega od dodatkov.
• Lise 1b, 2b in 3b smo obdelovali z RNazo, pri čemer je 1b kontrola (tu RNaza ni prisotna), zaradi česar je RNA lepo vidna.
• Slika vzorca 7 je zelo slabo vidna; velik del komponent vzorca smo verjetno izgubili med obdelavo zaradi nenatančnosti.
• Tudi če ne bi imeli plazmidov v prekonočni kulturi bi morali videti vsaj nekaj celične DNA.
• Sama izolacija plazmidov je slaba. V žepkih 12, 13 jih ni. V žepku 15 in 16 se lepo vidi vpliv koncentracije RNaze.
• Pri metodi s kuhanjem dobimo manj RNA, ker se je del med kuhanjem denaturira.
• Z večanjem koncentracije RNaz se zmanjša količina RNA, ki je potovala s fronto.
• Če bi RNaza razgrajevala samo RNA molekule bi morala biti število ali pa vsaj lega lis pri obeh dodatkih različni.
• Vpliv dodatka RNaze pri alkalni lizi: Celotni izkoristek reakcije je največji v primeru alkalne lize brez dodatka RNaze, sledi vzorec encimska liza brez dodatkov in pri skupini 2 vzorec encimska liza z dodatkom LiCl, zato ker je imela največji izkoristek pri izolaciji, saj v tem primeru nismo dodali RNaze.
• LiCl s povišano ionsko močjo povzroči obarjanje RNA z več kot 300 bp, kar vpliva na izboljšanje izolacije plazmidne DNA.
• Predvidevamo, da smo z LiCl uspešno oborili veliko količino RNA, ki je bila v prvotnem vzorcu še prisotna. Metoda ni primerljiva z metodo uporabe RNaze. Tu se RNA znebimo, v primeru dodatka RNaze se ta le hitreje premika po gelu.
• Za RNA potuje plazmidna DNA z naraščajočo stopnjo superzvitosti. Ker vemo, da hitrost migracije cirkularne dsDNA narašča z njeno stopnjo superzvitosti, lahko na podlagi tega ugotovimo, katerim topološkim oblikam pripadajo posamezne lise.
• Po dodatku CTAB je v vzorcu manj RNA zaradi boljše izolacije DNA v primerjavi z RNA.
• Glede na to, da se je pri dodatku CTAB v našem primeru izkoristek zmanjšal, lahko sklepamo, da se je CTAB vezal na nukleisnke kisline.
• Vzorce smo nanesli na gel in počakali, da je bila elektroforeza končana.
• Najhitreje so na gelu potovale majhne molekule RNA, in sicer zaradi svoje majhnosti.
• RNA sledi scDNA, ki je po dolžini najkrajša.
• Ker gel ni vseboval EtdBr, smo lahko opazovali tudi konformacijske oblike plazmidne DNA. Te se med sabo razlikujejo po konformacijskih oblikah.
• Med kromosomsko DNA in RNA je nadzvita oblika.
• PEG je dober za DNA, ker omogoča vezavo encimov na DNA.
• Primerjava rezultatov pokaže, da smo največ DNA izolirali, če smo dodali PEG, prav tako pa smo dobili tudi največ kontaminant.
• Etid. bromid poudari intenziteto lis, ker je barvilo, ki se vgradi med bazne pare.
• Če bi vzeli še več EtdBr na koncu, bi bile lise še bolj vidne.
• Pri večini vzorcev so opazni repi, kar je slabo.
• Pri dodatku PEG je opaziti nekoliko večjo koncentracijo plazmidov.
• Dodatek PEG povzroči večji izkoristek plazmidne DNA; količina preostale RNA je neopazna.
• Rezultati se bolj ali manj ujemajo s pričakovanji.
• Zadnji reagent je bil CTAB in tudi tu je DNA veliko bolj prepoznavna, enako kot pri LiCl, le da ima več DNA.
• Pri nadaljnji obdelavi vzorca pa vidimo, da dobimo večji izkoristek plazmidov pri obdelavi z RNazo kot pa pri obdelavi z ostalimi dodatki.
• V literaturi je navedeno, da se CTAB veže na proteinske in polisaharidne komponente celic v pogojih visoke ionske jakosti, v pogojih nizke ionske jakosti pa na nukleinske kisline, iz česar lahko sklepam, da se je pri pogojih, pri katerih smo izvajali naš poskus, veliko DNA vezalo na CTAB in smo jo s tem izgubili.
• Rezultati gelčkov vidno prikažejo kako hitro se lahko zmanjša izkoristek dela ali se ohrani večja količina nečistoč v našem vzorčku zaradi manjših odstopanj v pripravi.
• Padec izkoristka je mogoče pričakovati pri vseh vzorcih kjer smo bili večkrat temu tudi izpostavljeni.

Naloga III (izolacija plazmidne DNA v srednjem obsegu)

• Rdeč kvadrat označuje del gela, kjer se nahajajo najini vzorci (oziroma, kje bi bili, če bi jih bilo kaj).
• Slika 1 prikazuje nanos vzorcev po izolaciji večjih količin plazmidne DNA na agarozni gel.
• Pričakoval sem, da bo pri 3x večjem nanosu vzorca tudi 3x večja koncentracija, do tega je tudi prišlo.
• V žepek 1 smo nanesli trikrat manjšo količino plazmidna DNA kot v žepek 2, zato bi ričakovali, da bo tudi koncentracija trikrat manjša.
• V lisah 1 in 2 ni opaziti veliko nečistoč (ozadja), saj so lise lepo vidne.
• Lise, ki sva jih s partnerko dobila, so v zgornjem desnem kotu.
• Spodnja lisa predstavlja superzvito obliko pDNA, zgornja lisa pa preostalo pDNA. Skupaj predstavljata pDNA z maso 300 ng.
• Na gelu opazimo 2 kromosomski obliki DNA: spodnja lisa predstavlja superzvito obliko. Zgornja lisa predstavlja DNA, ki se je "ujela na primesi".
• Lise, ki jih vidimo, so večinoma posledica dodatno zvite plazmidne DNA, kromosomske DNA je manj.
• V žepku 11 so neraztopljene snovi (raztopljene v TE pufru).
• V neraztopljenem vzorcu imava še veliko plazmida, na vrhu žepka pa so vidne agregirane snovi, ki niso potovale, ostale so na istem mestu.
• Kljub temu sva dobili veliko plazmida- 422 ng / / ul oz.127/ug.
• Na vsaki izmed prog je opaziti več lis. Lisa z največjo molekularno maso pripada DNA. To je DNA, ki je med izolacijskim postopkom plazmida, preko večjih por ušla iz jedra in je prisotna pri nadaljnji obdelavi vzorca.
• Iz preračunavanjem sem prišel do sklepa, da je koncentracija naše plazmidne DNA v vzorcu nekje 175 ng/ul vzorca.

Naloga IV (kloniranje DNA)

• Namen: V vektor pET32a vključiti fragment kokošjega cistatina, izoliranega iz plazmida pGM1b, pripraviti kompetentne celice in izvesti transformacijo ligacijskega produkta.
• Namen: Prenesti plazmid v ekspresijski vektor in vnos v kompetentne celice.
• Namen vaje je ustvariti rekombinatno vektorsko molekulo in jo pomnožiti v bakterijskih celicah v procesu transformacije.
• Namen: Izolacija zapisa za kokošji cistatin iz pGM1, njegova ligacija v vektor pET32, transformiranje konstrukta v E. coli DH5alfa ter njegovo kloniranje.
• Porabo vsakega od encimov smo preračunali glede na porabo za rezanje plazmida iz bakteriofaga lambda.
• Koncentracija DNA, ki se je nanašala na elektroforezo naj bi bila med 300 ng in 1,5 ug. Mi smo jo imeli za svoj pGM1b 10,4 ug, kar je bilo dovolj za 1 žepek.
• Pri pGM1 sta na gelu vidni dve lisi, kar lahko pomeni, da je bilo nekaj plazmida v superzviti obliki in encim ni mogel dobro rezati.
• Na sliki vidimo, da je v žepkih 11 in 12 (najina vzorca) prišlo do uspešnega rezanja plazmidov.
• Tudi pri mojih vzorcih, v žepku 4 razrezan pET32 in v žepku 5 razrezan pGM1b, je prišlo do uspešnega 1. rezanja z EcoRI.
• Pri plazmidu pET32a so pri linearizaciji nastale druge oblike kot smo pričakovali. Pri plazmidu pGM1b imamo tri močne lise, kar kaže, da je bilo rezanje uspešno.
• Dve lisi smo dobili zato, ker cepitev ni potekla na vseh molekulah, ali pa gre za mešanico rezanega in nerezanega plazmida.
• Pri pET32 so še vidne ostale oblike plazmida, zato ni prišlo do uspešnega rezanja.
• Nekaj kromosomske DNA je ostalo v žepkih, drugače pa smo dobili velikost fragmentov ~10 kb kar je ~42 ng DNA.
• Precej čuden je položaj najhitrejše lise plazmida pET-23a, saj je le-ta hitrejša od najhitrejše lise v kontrolnem vzorcu. To bi bila lahko superzvita krožna plazmidna DNA.
• potrebna količina enot HindIII: 1 enota=0,2219 pmol. C(pGM1)=20 U/ul.
• Velikost lise z dodatno zvito DNA se je navidez spremenila, kar pomeni, da je encim EcoRI rezal plazmid.
• Ker plazmid po gelu potuje v večih konformacijah vidimo pri nerazrezani koloni tri lise za pET32a, vektor pGM1b je malo bolj nejasen. Pri drugem rezanju ni kaj dosti za komentirat.
• V ligacijski reakciji smo imeli le 40% celotne vektorske DNA in DNA inserta, ker smo za nadaljnje reakcije potrebovali manjši volumen.
• Kompetentne celice smo redčili tako, da smo na LBA plošče nanesli enkrat 14 ul plazmida za določanje frekvence transformacije, drugič pa 140.
• Insert smo dodali v prej pripravljene kompetentne celice.
• Naš plazmid pET32 zelo verjetno ni dodatno zvit in tako težje vstopa v bkt celice v primerjavi s kontrolnim.
• Pripravili smo tri LB Amp plošče. Na prvo smo nanesli 5 ul plazmida, na drugo 250 ul plazmida, na tretjo 100 ul našega produkta s kompetentnimi celicami.
• Kompetentne celice smo redčili tako, da smo na LB Amp plošče nanesli enkrat 5 ul plazmida za določanje frekvence transformacije, drugič pa 250 ul. Na eno ploščo pa smo nanesli naš ligacijski produkt in kompetentne celice. Čez teden dni smo prešteli kolonije, ki so zrasle na ploščah.
• Na plošči pričakujemo 21 kolonij, če na ploščo razmažemo 1 ml kulture celic, ki smo jim dodali 1 ul plazmida.
• Iz 1 ml kulture, ki smo jo inkubirali z 2,1 fmol plazmida, smo odpipetirali 10 ul, dodali 40 ul medija LB in razmazali na ploščo.
• Na ploščo smo nanesli 250 ul, s tem smo nanesli le 1/4 kolonij in zato smo na plošči po inkubaciji pričakovali 43 kolonij.
• Z medijem smo redčili 1000x in nanesli na ploščo (5 ul v 245 ul in od tega smo na ploščo nanesli 50 ul).
• Da bi dobili na plošči 100 kolonij, smo izhodne 3 fmol vektorja v prvem primeru redčili 300-krat.
• Na eno ploščo smo nanesli naš ligacijski produkt in kompetentne celice. Čez teden dni smo prešteli kolonije, ki so zrasle na ploščah ter izračunali frekvenco transformacije.
• 200 ul kulture celic in 800 ul medija LB smo dodali 25 ul ligacijskega produkta.
• Nanesli smo približno 100 ul raztopine celic.
• Na plošči s pUC19 je zraslo 240 kolonij.
• Na ploščah, na katerih smo preverjali frekvenco transformacije je zraslo toliko kolonij, da bi bilo štetje le teh opravilo, nehvaležno do te mere, da se ga močni želji navkljub nismo lotili.
• Na gojišču transformiranih celic nama ni zrastla niti ena kolonija, kar kaže na neuspešno ligacijo. Vendar, ker sva porabila vse kompetentne celice že pri ligaciji, nisva naredila kontrole, tako da kaj je šlo narobe z gotovostjo ne morem trditi.
• Eni skupini pa transformacija kontrolnih vzorcev ni uspela lahko ker: pozabili dodati insert, grobo delali s kompetentnimi celicami,...
• S kontrolo smo št. pripravljenih kompetentnih celic ocenili na 2-3x10E5.
• Frekvence transformacije plazmidov v bakterijske celice E. coli seva DH5alfa so bile v primerjavi s frekvencami treansformacije v sev BL21 [DE3] v povprečju višje za faktor 10. V sev DH5alfa se plazmidi lažje transformirajo, saj ima le-ta sev več nukleaz.
• Na agarnih ploščah, na katerih bi morale zrasti kolonije ligacijskega produkta, smo dobili veliko zelo majhnih kolonij, ne pa kolonij, ki smo jih pričakovali.
• Pozitiven rezultat (da kolonija na tem gojišču raste), je dokaz, da je v procesu transformacije bakterijskh celic prišlo do vstavitve plazmida (insert z zapisom za rezistenco na Amp) v kompetentne celice.
• Napaka je bila najbrž v delu: lahko so bile prisotne celice rezistentne na ampicilin, ker je bilo na ploščah ogromno kolonij.
• V najinem primeru nismo dobili ligacijskega produkta. Kolonije, ki smo jih analizirali, so po vsej verjetnosti plazmid PMD91. Mislim, da sta kolega, ki sta dobila 271 kolonij na petrijevki, kjer bi moral biti samo ligacijski produkt, nekako kontaminirala petrijevko s tem plazmidom.
• Zanimalo nas je, ali imajo kolonije res vključen ligacijski produkt.
• Ligacijske kulture smo precepili, ter nato kulture, ki so uspevale v gojišču z ampicilinom - naše transformante analizirali - ugotavljali smo prisotnost plazmida - konstrukta pET32/kokošji cistatin.
• Pri rekombinantnem vektorju bi opazili liso samo pri rezanju z EcoRI in HindIII, pri pET32 tudi, a bi potovali hitreje, pri pGM1 pa bi opazili lisi tako pri prvem rezanju kot pri drugem, s tem, da bi bila lisa malce hitrejša pri drugem (EcoRI in HindIII).
• Kljub nizki frekvenci transformacije lahko trdimo, da se je plazmid pUC19 vgradil v gostiteljev genom.

Naloga V (izražanje zapisa)

• Naslov: Rast kvasnih celic v kulturi, indukcija ekspresije in izolacija ter ekspresija izoliranih proteinov
• Namen: Indukcija ekspresije kokošjega cistatian v E. coli z IPTG, primerjava izražanja v celotnem celičnem lizatu pred in po indukciji ter primerjava izražanja v sferoplastni in periplazemski frakciji po indukciji, na NaDS-PAGE.
• Namen: Indukcija izražanja kokošjega cistatina v bakterijah E. Coli, preverjanje izražanja z NaDS-PAGE, potrditev izražanja in test aktivnosti izraženega proteina na substrat BANA.
• V periplazmi kvasovk je torej nek protein, ki inhibira papain.
• V 1. žepek sem nanesla DH5alfa s plazmidom pUC19.
• Izražanje induciramo z dodatkom IPTG, ki je analog substrata in veže represor lac, tako da RNA-polimeraza E. coli lahko prične s prepisovanjem zapisa, ki se nato prevaja v protein.
• Inducirali smo ekspresijo proteina, ga izolirali v periplazemski frakciji in v obliki sferoplastov, da bi lahko pokazali, kje se protein eksprimira.
• Ločbo smo izvedli na gelu. Izolacija ni uspela, zato smo prisotnost kokošjega cisteina v obeh frakcijah dokazali z aktivnostnim testom.
• slika: Analiza periplazemske in sveroplastne frakciej na NADS.
• Tabela 1: merjenje absorbance prekonočne kulture pri 550 nm in 280 nm pred in po dodatku IPTG.
• slika: žepek 1: standard, žepek 4: celični lizat neinduciran, žepek 5 celični lizat induciran z IPTG
• Na sliki 2 je prikazana NaDS-PAGE inducirane celične in periplazemske frakcije.
• slika 2: analiza celičnih lizatov nanešenih na NaDS-PAGE pred in po indukciji z IPTG
• Izražanje smo inducirali z IPTG-jem. Imeli smo dva vzorca enega pred in enega po indukciji. Iz njiju smo pripravili štiri vzorce - dva celotna celična lizata (pred in po indukciji), ter pri izolaciji periplazemske frakcije dobljeno celično frakcijo ter periplazemsko frakcijo.
• Podobno je vpliv indukcije na samo koncentracijo proteina na gelu možno le netočno opredeliti.
• Zaradi izredno slabih rezultatov in vidljivosti, se z gela nič ne vidi.
• Standard s proteini znanih Mw nam je omogočil potrditi obstoj cistatina.
• Zapis za kokošji cistein je velik 370 bp, kar pomeni (370/3*110=12000 Da). /.../ Ostale lise, ki so izven pričakovanega območja za kokošji cistein, so najverjetneje drugi celični ostanki.
• S pomočjo standarda in vodje vaj smo ocenili koncentracijo cistatina v periplazemski frakciji 13.5 kDa.
• Slika 2 predstavlja poliakrilamidni gel, na katerem je 9 žepkov. Prvi žepek je standard, v osmem in devetem pa sta najina vzorca.
• Fragment, ki ga pričakujemo - zapis za kokošji cistatin, se nahaja med zadnjima dvema lisama našega standarda - to je med 14000 in 6000 in je velik približno 12 kDa. Iz prvega gela vidimo, da pri vzorcu št. 6 ne vidimo te lise oz. ni tako močno izražena. Vzorcu št. 7 pa smo dodali IPTG in zasledimo liso okrog 12 kDa.
• Iz slike 1 je razvidno, da zadnji dve lisi na poliakrilamidnem gelu ustrezata približno 6000 Da in zadnja lisa 14000 Da. Med tema dvema lisama je pričakovani kokošji cistatin, kar se vidi tudi iz rezultatov.
• Celični lizat vsebuje pribl. 80 % vseh periplazemskih proteinov. /.../ Analiza periplazemske frakcije je pokazala, da je rekombinantni kokošji cistatin prisoten tudi v periplazmi, kar sklepamo na osnovi priloženih standardov.
• Ob času nič lise za protein ni bilo, medtem ko je lisa pri našem vzorcu lepo vidna. Po standardih lahko rečemo, da gre v tem primeru za kokošji cistatin, ker lisa za kokošji cistatin pride na elektroforezi okoli 13.5 (to je malo višje, kot bi dejansko morala – 14.4).
• Na sliki 1 je NaDS-PAGE, in sicer v 1. žepku: celotni celični lizat pred indukcijo, 2. žepek: celotni celični lizat po indukciji, 3. žepek: (...). V 2. žepku opazim močnejše lise in tudi še 2 dodatni lisi proti koncu gela, ki lahko predstavljata kokošji cistatin. 3. žepek, kjer se nahaja periplazemska frakcija, je brez vidnih proteinskih lis. Zato z gotovostjo ne morem trditi, da je najhitrejša lisa 2. žepka prav cistatin.
• Vidimo, da je v celotnem celičnem lizatu prišlo do izražanja kokošjega cistatina po indukciji z IPTG.
• V drugem delu vaje smo izvedli elektroforezo celične in periplazemske frakcije ter poskušali ugotoviti, koliko proteina je prisotnega v topni (periplazma), koliko pa v netopni obliki (celice).
• Iz slike 2 je razvidno, da je pri celičnem preostanku in pri periplazmi veliko lis. To je bilo za pričakovati - veliko celičnega materiala sta vsebovala vzorca. Pri periplazmi je seveda malo manj lis.
• Iz gela, na katerem smo izolirali celične in periplazemske frakcije, je razvidno, da je več proteinov v celičnih frakcijah, kar se ne ujema s pričakovanji. [na priloženem elektroferogramu pa je bilo več lis pri periplazemski frakciji kot pri celičnem preostanku]
• Izolacija periplazemske frakcije ni dobro vidna, saj je očitno večji del proteinov ostal v periplazmi.
• Iz slike je razvidno, da pred dodatkom induktorja IPTG ni prišlo do proizvodnje proteinov, medtem ko so se po indukciji sintetizirale večje količine proteina z maso približno 15 kDa.
• Kokošji cistatin je bil v manjših količinah prisoten tudi pred dodatkom IPTG, verjetno zaradi nizkih ravni ekspresije lac-represorja v celici in prisotnosti konstitutivnega promotorja Plpp na pGM1b.
• Fragment, ki ga pričakujemo - zapis za kokošji cistatin se nahaja med zadnjima dvema lisama našega standarda, to je med 14000 in 6000 in je velik približno 12 kDa. Iz prvega gela vidimo, da pri vzorcu št. 2 ne vidimo te lise pri vzorcu št. 3 pa smo dodali IPTG in zasledimo liso okoli 12 KDa. IPTG torej pomaga bolj izražati zapis za kokošji cistatin.
• Opazimo tudi, da je kar nekaj cistatina tudi v celični frakciji, kar lahko pomeni, da smo predolgo sonificirali ali pa da protein nakljub signalnemu zaporedju ni prišel na svoje mesto. Slednje niti ni nenavadno, saj so npr. odkrili proteine s signalnim zaporedjem za ekstracelularni matriks v mitohondrijih.
• Na elektroforeznem gelu pričakujemo za cistatin dve lisi z majhno razliko v molekulski masi, ker obstaja v celici v dveh oblikah: z signalno sekvenco za v periplazmo in brez signalne sekvence.
• Pri najinem vzorcu periplazme je opaziti intenzivne signale v zgornjem delu gela. Ti signali so tako intenzivni zaradi tega, ker sem naredil napako v postopku izolacije periplazme. Namesto da bi epico med razbijanjem celic le rahlo stresal, sem jo dal na vorteks.
• Naslednji dan smo vzorcu, ki smo mu dodali IPTG, izmerili absorbanco (prej smo ga 10 krat redčili) in abosrbanca po redčitvi je bila 0,433.
• Če pogledamo absorbanco pri testu BANA, lahko vidimo, da se pri pET in pUC ne spreminja, ker ni rekombinantnega proteina, ki bi inhibiral, zato je aktivnost prisotna povsod.
• Pri najinem vzorcu so absorbance nekoliko nezanesljive, saj je aktivacija prenizka že pri sami kontroli.
• Iz tabele je razvidno, da je v sevu SCS1 E. coli prišlo do popolne inhibicije papaina.
• Če primerjamo DH5alfa brez inserta in DH5alfa z insertom (v periplazmi) vidimo, da tu vrednosti malo padajo.
• Naša kontrola ni kazala pretirane inhibicije, kar je v redu.
• Več kot smo dodali periplazemske frakcije, več papainov je bilo inhibiranih.
• Papain sam brez inhibitorja ne more biti bolj aktiven kot če vzorcu dodamo inhibitor.
• Če dodamo 200 ul vzorca, je inhibicija skoraj 100%. Torej predvidevamo, da je v vzorcu periplazme res nastal želeni produkt (cistatin).
• Promotor je očitno deloval že brez IPTG-ja.
• Ker je periplazma bolj primerno okolje za izražanje proteinov z disulfidnimi mostički, mislim, da bi pri izražanju v citoplazmi dobili manj produkta.

Naloga VII (polimorfizem STR in VNTR)

• Naslov: Pomnoževanje polimorfizma STR DNA, izolirane iz človeških celic
• Namen: S PCR namnožiti STR na 3. kromosomu in analizirati dobljene produkte s SDS-PAGE.
• Namen vaje je bila izolacija lastne DNA iz celic ustne slinavke in pomnožitev enega od polimorfnih segmentov s PCR:
• Namen je seznaniti se z metodo, ki nam pomaga pri iskanju obsojencev, očetovstva in še kje.
• Naš namen je bil izolirat DNA iz celic ustne slinavke, pomnožit specifično zaporedje z uporabo metode PCR in določit število ponovitev zaporedja GATA pri posameznikih na 3. kromosomu.
• Pri vaji naj bi pridobili genomsko DNA iz celic ustne sluznice in s pomočjo PCR pomnoževali enega izmed tandemskih segmentov ter ga ločili z elektroforezo.
• Kot rezultat smo dobili 8% poliakrilamidni gel.
• Svojo DNA celic ustne sluznice sem nanesel v 4 kolono levega gela.
• PAGE produktov PCR ni uspela, ker na gelu nismo dobili obeh lis za barvila. Vzrok je naj verjetneje bilo predolgo segrevanje. Dolgo pa smo segrevali, da na gelu ne bi dobili preveč lis.
• Vzorec genomske DNA smo analizirali z agar. elektroforezo. V žepku se vidi lisa, ki bi lahko bila kromosomska DNA, lahko bi bila pa tudi plazmidna DNA.
• Na vrhu gela opazimo genomsko DNA (PCR je uspel).
• Moj vzorec se nahaja v 11. žepku. V njem ni vidne nobene lise, pa tudi po gelu, kjer naj bi potovala DNA, lise ni.
• Odločili smo se, da naredimo analizo na agaroznem gelu, da ugotovimo, ali je kaj kromosomske DNA in ali je prisotno kaj RNA. Torej je tisto, kar se sveti, DNA ali RNA. RNA se v agaroznem gelu hitro odcepi, DNA pa ostane v žepkih.
• Iz slike elektroforeze je razvidno, da je genomska DNA bila izolirana, da so se primerji vezali, prisotne pa so tudi nekakšne druge snovi, ki motijo interpretacijo.
• V vseh kolonah vidimo vsaj dve lisi, kar pomeni, da imamo po en alel od obeh staršev.
• Določene lise lahko pripišemo tudi ostankom genomske DNA.
• Na žalost rezultatov nismo dobili, zato smo se lotili vzrokov našega neuspeha.
• Iz rezultatov sklepamo, da je bilo nekaj narobe v postopku jemanja vzorca celic, lahko pa so bile napake tudi kje drugje.
• Naš elektroforezni gel ni dober, zato na osnovi teh rezultatov ne morem sklepati na pogostost posameznih ponovitev v populaciji.
• Iz gela ne vidimo razlik nekaj baznih parov, zato ne moremo pri nobenem vzorcu trditi ali gre za homozigote, heterozigote ali hemizigote.
• Pri naših vzorcih na gelu smo dobili fragmente v tem območju, vendar je zraven veliko šmira, ki ga ne moramo točno definirati.
• Na podlagi zgornje slike lahko težko sklepam na kaj konkretnega, vse je bolj ali manj špekulacija.
• Verjetno so se zaradi nezadostne temperature pri PCR tvorili dimeri ali pa dodatne sekundarne strukture.
• Spodnji del gela je tudi zelo slabo obarva, saj je etidijev bromid potoval v nasprotni smeri ločevanja in ga zato na spodnji strani gela ni ostalo veliko.
• Primerji bi se lahko prijeli na neko mikrobno DNA, saj je v ustih veliko mikrobnih celic, ki jih je lažje zajeti v vzorec kot pa lastne celice z genomsko DNA.
• Barvili v nanašalnem pufru sta bili bromfenolmodro (označuje potovanje fronte, vijoličasta barva 45 bp velika spojina) in ksilencianol (svetlo modra barva, 140 bp).

---

Nazaj na Vaje iz tehnologije rekomb. DNA.

Vprašanja, komentarji: Marko Dolinar.