IGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju

iGEMINI je projekt v okviru tekmovanja iGEM, ki ga je leta 2020 pripravila ekipa dodiplomskih študentov iz Toulouse v Franciji.

Spletna stran projekta iGEMINI: https://2020.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS

Avtorica povzetka: Klementina Polanec

Problem

Astronavti so v vesolju izpostavljeni ekstremnemu okolju, ki lahko ima škodljiv vpliv na njihovo zdravje. Večja izpostavljenost sevanju, višje koncentracije CO₂ in mikrogravitacija kratkoročno vplivajo na počutje, dolgoročno gledano pa lahko astronavti začnejo izgubljati mišično maso in kosti, imajo povečano tveganje za kardiovaskularne težave in oslabljeno delovanje imunskega sistema. Uravnotežena prehrana bogata s hranili je za astronavte ključna, saj lahko zmanjša negativne vplive okolja na zdravje [1]. Pomemben del uravnotežene prehrane so vitamini, med katerimi je 13 esencialnih in se priporoča njihovo vsakodnevno uživanje [2].

Trenutno si astronavti na mednarodni vesoljski postaji hrane ne pripravljajo sami, temveč vsakih nekaj mesecev dobijo z Zemlje pošiljko sveže ter dehidrirane in konzervirane hrane [3]. Prvi problem vnaprej pripravljene hrane je, da se med samo pripravo razgradijo številni esencialni vitamini, predvsem manj odporni (vitamin A oziroma retinol, vitamin C, folat in tiamin) [4]. Drug in še večji problem pa je, da se konzervirana hrana shranjuje tudi po več mesecev in daljši čas shrambe pomeni več razgrajenih vitaminov [5]. Tako je na primer razgradnja retinola v odvisnosti od časa eksponentna in po 6 mesecih shrambe se ga razgradi kar 44 % [5, 6].

Zaradi opisanih problemov je v vesolju težje poskrbeti za prehrano dovolj bogato z vitamini, prav tako pa so daljša potovanja po vesolju zaenkrat nemogoča [1,2].

Rešitev: projekt iGEMINI

Ekipa iz Toulouse si je zamislila kokulturo, ki bi jo astronavti lahko gojili na raketi in z njo pridobivali prehranska dopolnila. Ekipa se je odločila za pridobivanje β-karotena (provitamin A), saj je vitamin A eden najmanj stabilnih vitaminov [5], prav tako pa ima pomembno vlogo pri celični diferenciaciji in vidu [7]. Prehransko dopolnilo bi lahko astronavti prilagodili svojemu okusu in s pomočjo optogenetske regulacije izbirali med 3 okusi: naraven okus kvasovke, limona ali sladka vrtnica [6].

Osnove o kokulturi

Kokulturo bi sestavljali kvasovka Saccharomyces cerevisiae in bakterija Clostridium ljungdahlii. Kokulturo so zasnovali na tak način, da bi kot vir ogljika in dušika uporabljala odpadke, ki nastanejo pri recikliranju organskih snovi na raketi. Vir ogljika bi predstavljal CO₂ iz zraka, vir dušika pa organske molekule iz urina [6].

Saccharomyces cerevisiae

Kvasovko bi gensko spremenili, tako da bi lahko proizvajala β-karoten, dodali pa bi ji tudi optogenetske elemente, preko katerih bi s spremembo svetlobe spremenili njen okus [6]. Ker je kvasovka splošno prepoznana kot varna, prav tako pa že sama po sebi proizvaja tudi vitamine B in druga hranila [8], bi jo astronavti lahko uživali kot prehransko dopolnilo [6]. To je že ustaljena praksa na Zemlji [9].

Clostridium ljungdahlii

Ker je kvasovka heterotrofna, ni zmožna uporabljati odpadnega CO₂ kot vir ogljika [10]. Ekipa se je zato odločila za kokulturo z bakterijo C. ljungdahlii, ki lahko raste tudi avtotrofno, pri čemer reducira CO₂ do organskih spojin, kot vir elektronov pri pretvorbi pa uporablja H₂ (prav tako odpadek na raketi) [11]. Bakterija lahko torej na osnovi odpadnih virov proizvede etanol in acetat, ki kvasovki predstavljata vir ogljika [6].

Moduli sistema

Modul 1: sinteza hranil in okusa

Prvi modul sestavljajo biokocke, ki so namenjene integraciji v genom kvasovke:

Koda	Opis biokocke
BBa_K3570002	Konstitutivna sinteza β-karotena v kvasovki.
BBa_K3570000	Konstitutivna povečana sinteza geranilgeranil pirofosfata v kvasovki.
BBa_K3570001	Kvasovki da okus po sladki vrtnici.
BBa_K3570003	Kvasovki da okus po limoni.

Biokocka BBa_K3570002

Ekipa je v kvasovki želela proizvajati β-karoten, za kar sta potrebna 2 encima iz kvasovke Xanthophyllomyces dendrorhous: fitoen desaturaza (CrtI) in likopen ciklaza/fitoen sintaza (CrtYB). Encima katalizirata serijo reakcij, pri katerih iz geranilgeranil pirofosfata (GGPP) nastane β-karoten (slika sintezne poti) [6, 12]. Ker je CrtYB transmembranski protein, CrtI pa citosolni, so se odločili za fuzijo obeh encimov, s čimer je encimska pretvorba hitrejša [12].

Biokocka BBa_K3570000

β-karoten nastaja iz GGPP, zato se je ekipa odločila, da bo v kvasovki skušala povečati sintezo GGPP. To so želeli doseči s pomočjo 2 encimov: GGPP sintaze (CrtE) iz X. dendrorhous in krajše verzije 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A reduktaze 1 (tHMG1) iz S. cerevisiae (slika obeh pretvorb) [6].

Biokocki BBa_K3570001 in BBa_K3570003

Izbiro okusa kvasovk bi ekipa prepustila astronavtom, zato so se odločili, da bo sinteza molekul, ki dajo okus, inducibilna s pomočjo optogenetike. Zaradi preprostosti so izbrali okusa po sladki vrtnici ter po limoni, saj obe molekuli za okus nastaneta iz geranil pirofosfata (prekuzor GGPP) z eno samo encimsko pretvorbo [6]. Za okus po sladki vrtnici sta potrebni 2 molekuli: geraniol, ki ima aromo vrtnice [13] in brazzein, ki je majhen polipeptid z izjemno sladkim okusom [14]. Geraniol nastane iz geranil pirofosfata z encimom geraniol sintaza iz Catharanthus roseus. Biokocka BBa_K3570001 je sestavljena tako, da vsebuje dvosmerni inducibilni promotor Gal1/10, tako da se v eno smer izrazi gen za geraniol sintazo, v drugo smer pa gen za brazzein. Preko restrikcijskih mest XbaI in BamHI se lahko vstavi ustrezno optogenetsko vezje [6].

Za okus po limoni je potrebna ena sama molekula: limonen, ki nastane iz geranil pirofosfata z encimom limonen sintaza. Biokocka BBa_K3570003 vsebuje gen za limonen sintazo pod dvosmernim inducibilnim promotorjem Gal1/10, vsebuje pa tudi restrikcijski mesti XbaI in BamHI za vnos optogenetskega vezja [6].

Modul 2: regulacija okusa preko optogenetike

Optogenetika temelji na uporabi proteinov, ki ob prisotnosti svetlobe točno določene valovne dolžine spremenijo konformacijo in s tem postanejo aktivni transkripcijski faktorji (TF) [15]. Ekipa si je zamislila, da bi lahko astronavti z izbiro modre ali rdeče svetlobe inducirali nastajanje molekul za okus v kvasovkah in tako spremenili okus prehranskega dopolnila. Odločili so se za uporabo modrega optogenetskega sistema EL222 in rdečega optogenetskega sistema PhyA/FHY1 [6]. Razvili so biokocki:

Koda	Opis biokocke
BBa_K3570005	Moder optogenetski sistem v kvasovki.
BBa_K3570004	Rdeč optogenetski sistem v kvasovki.

Moder optogenetski sistem temelji na uporabi TF EL222 iz bakterije Erythrobacter litoralis. Na modri svetlobi (450 nm) EL222 homodimerizira in izpostavi DNA-vezavno domeno, s katero se lahko veže na umetni promotor C120. V kvasovkah EL222 sam po sebi ne more delovati kot TF, zato je potrebna fuzija s proteinom VP16 (protein virusa herpes simplex, ki deluje kot TF) in jedrnim lokalizacijskim signalom (NLS) [16]. Sistem torej deluje tako, da modra svetloba inducira izražanje gena pod promotorjem C120.

Biokocka za moder optogenetski sistem vsebuje gen za NLS-EL222-VP16 pod konstitutivnim promotorjem ter gen za GFP pod dvosmernim inducibilnim promotorjem C120. Deli biokocke so namenjeni vnosu v biokocko za okus, in sicer se lahko promotor C120 preko restrikcijskih mest XmaI-SalI zamenja s promotorjem Gal1/10, preko restrikcijskih mest XbaI-BamHI pa se lahko vstavi gen za NLS-EL222-VP16 skupaj s promotorjem in terminatorjem (slika levo spodaj). Ekipa je želela združiti moder optogenetski sistem z okusom po limoni, tako da bi kvasovke na modri svetlobi začele proizvajati limonen [6].

Rdeč optogenetski sistem deluje na podoben način kot moder (več informacij), le da je tu potreben promotor Gal1/10. Biokocka za rdeč optogenetski sistem vsebuje pod dvosmernim konstitutivnim promotorjem gena za fuzijska proteina, ki na rdeči svetlobi interagirata in tvorita aktiven transkripcijski faktor. Celotno biokocko lahko preko restrikcijskih mest XbaI-BamHI vstavimo v biokocko za okus (slika desno spodaj). Na tak način je ekipa želela združiti rdeč optogenetski sistem z okusom po sladki vrtnici [6].

Modul 3: gojenje kokulture

Ekipa si je zamislila, da bi z ustreznim bioreaktorjem kvasovko in bakterijo med seboj ločili, saj bakterija ni prepoznana kot varna za uživanje, omogočili pa bi kroženje gojišča in s tem hranil. Sestavine gojišča so prikazane na sliki, prav tako pa bi v bioreaktor dovajali pline (CO₂, H₂ in O₂) ter odpadni dušik iz urina. Kisik kvasovka nujno potrebuje za rast in bakterija je aerotolerantna do 8 % p(O₂) v gojišču. Kokulturo bi gojili pri temperaturi 33 °C in pH 5,5 [6].

Eksperimenti in rezultati

Pandemija COVID-19 je ekipi otežila delo v laboratoriju, zato večino zastavljenih eksperimentov niso mogli izvesti. V omejenem času jim je uspelo narediti številna kloniranja, s čimer so želeli sestaviti in okarakterizirati vse v modulih omenjene biokocke. Do končne funkcionalne oblike jim je uspelo sestaviti le eno, in sicer biokocko za povečano sintezo GGPP (BBa_K3570000) [6].

Nato so za biokocko preverili, če res omogoča povišano nastajanje GGPP. Transformirali so S. cerevisiae BY4741 in izvedli ustrezno selekcijo. Zraslim kolonijam so s PCR preverili, če se je biokocka uspešno integrirala v genom in ugotovili so, da se je. Nato so transformirane kvasovke primerjali s kvasovkami divjega tipa, in sicer so z LC-MS primerjali količino GGPP v celicah. Ugotovili so, da so transformirane kvasovke imele petkrat več GGPP na biomaso kot kvasovke divjega tipa (graf). S tem so potrdili, da biokocka deluje, kot so si zamislili [6].

Sledili so še eksperimenti z monokulturama kvasovke in bakterije, s katerimi so ugotovili [6]:

• zamišljeno gojiščevsebuje snov, ki kvasovki preprečuje rast na acetatu in etanolu kot viru ogljika
• bakterija uspešno raste v fermentorju, uporablja CO₂ in H₂ ter pri tem proizvaja etanol in acetat
• kvasovka lahko uporablja etanol in acetat kot vir ogljika, prav tako pa začne rasti že pri nizkih koncentracijah enega izmed virov
• kvasovka porablja acetat in etanol hkrati

Zaključki

Kljub temu da ekipi eksperimentalno ni uspelo dokazati delovanje sistema, so s pomočjo modeliranja ugotovili, da bi z 1 L kokulture lahko v 24 urah proizvedli 3 dnevne doze β-karotena. To predstavlja velik uspeh za projekt iGEMINI in prislužili so si 2. mesto v skupini dodiplomskih študentov [6].

Viri

[1] A Successful Mission Starts With Nutrition | Science Mission Directorate https://science.nasa.gov/science-news/news-articles/a-successful-mission-starts-with-nutrition (pridobljeno 19. 4. 2021).

[2] Vitamins and Minerals for Older Adults | National Institute on Aging https://www.nia.nih.gov/health/vitamins-and-minerals-older-adults (pridobljeno 19. 4. 2021).

[3] G. L. Douglas, S. R. Zwart, S. M. Smith: Space Food for Thought: Challenges and Considerations for Food and Nutrition on Exploration Missions. J. Nutr. 2020, 150(9), str. 2242–2244.

[4] E. Lešková, J. Kubíková, E. Kováčiková, M. Košická, J. Porubská, K. Holčíková: Vitamin losses: Retention during heat treatment and continual changes expressed by mathematical models. J. Food Compos. Anal. 2006, 19(4), str. 252–276.

[5] P. Berry Ottaway: Stability of vitamins during food processing and storage. V: Chemical Deterioration and Physical Instability of Food and Beverages. Elsevier 2010, str. 539–560.

[6] Team:Toulouse INSA-UPS - 2020.igem.org https://2020.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS (pridobljeno 19. 4. 2021).

[7] J. A. Olson: Benefits and Liabilities of Vitamin A and Carotenoids. J. Nutr. 1996, 126(suppl_4), str. 1208S-1212S.

[8] M. E. Jach, A. Serefko: Nutritional Yeast Biomass: Characterization and Application. V: Diet, Microbiome and Health. Elsevier 2018, str. 237–270.

[9] Nutritional yeast - Wikipedia https://en.wikipedia.org/wiki/Nutritional_yeast (pridobljeno 19. 4. 2021).

[10] A. La, P. Perré, B. Taidi: Process for symbiotic culture of Saccharomyces cerevisiae and Chlorella vulgaris for in situ CO2 mitigation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2019, 103(2), str. 731–745.

[11] C. Leang, T. Ueki, K. P. Nevin, D. R. Lovley: A Genetic System for Clostridium ljungdahlii: a Chassis for Autotrophic Production of Biocommodities and a Model Homoacetogen. Appl. Environ. Microbiol. 2013, 79(4), str. 1102–1109.

[12] H. Rabeharindranto, S. Castaño-Cerezo, T. Lautier, L. F. Garcia-Alles, C. Treitz, A. Tholey, G. Truan: Enzyme-fusion strategies for redirecting and improving carotenoid synthesis in S. cerevisiae. Metab. Eng. Commun. 2019, 8, str. e00086.

[13] W. Chen, A. M. Viljoen: Geraniol — A review of a commercially important fragrance material. South African J. Bot. 2010, 76(4), str. 643–651.

[14] G. Hellekant: Brazzein a Small, Sweet Protein: Discovery and Physiological Overview. Chem. Senses 2005, 30(Supplement 1), str. i88–i89.

[15] R. M. Hughes, S. Bolger, H. Tapadia, C. L. Tucker: Light-mediated control of DNA transcription in yeast. Methods 2012, 58(4), str. 385–391.

[16] L. B. Motta-Mena, A. Reade, M. J. Mallory, S. Glantz, O. D. Weiner, K. W. Lynch, K. H. Gardner: An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat. Chem. Biol. 2014, 10(3), str. 196–202.