Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata

Antea-Glyphosate je projekt v okviru tekmovanja leta iGEM 2020, ki so ga pripravili študentje z univerze Xiamen na Kitajskem.

Povezava do projekta: https://2020.igem.org/Team:XMU-China

Avtor povzetka: Jernej Imperl

Uvod

Glifosat je eden od najširše uporabljanih herbicidov in mnoge raziskave nakazujejo na možne škodljive učinke za netarčne rastline, mikroorganizme in živali [1]. Kljub temu da človek v vsakdanjem življenju ni izpostavljen nevarnim količinam glifosata [1, 2], je njegova prisotnost v prsti in vodi zaskrbljujoča.

Ker glifosat v strukturi ne vsebuje nobenih kromofornih ali fluorofornih skupin, je njegova detekcija zapletena in zamudna. Prav tako bi bilo za učinkovito odstranjevanje glifosata iz okolja potrebno razviti hitro metodo, ki bi delovala pod različnimi okolijskimi pogoji [1].

Skupina iGEM iz univerze Xiamen na Kitajskem si je za cilj zadala rešiti ta dva problema in vzpostaviti sinteznobiološko rešitev za detekcijo in razgradnjo glifosata v prsti. Projekt so poimenovali Antea-Glyphosate, saj jim je idejo za projekt dal razmislek o intenzivni uporabi herbicidov pri pridelavi čaja. Pripravili so sistem za detekcijo glifosata in sistem za razgradnjo glifosata v prsti v vzorcu ter vsakega opremili s svojim stikalom smrti.

Poleg gensko spremenjenih bakterij so pripravili tudi merilni aparat, ki temelji na uporabi njihovega sistema za detekcijo glifosata in rezultate posreduje mobilni aplikaciji. V nadaljevanju je predstavljena predvsem sinteznobiološka plat njihovega projekta. Zaradi pandemije COVID-19 in omejenega časa za eksperimente so predstavljeni eksperimenti pretežno preliminarne narave (»proof of concept«).

Detekcija

Osnovni princip

Sistem za detekcijo glifosata z rekombinantno Escherichia coli temelji na njegovi delni razgradnji in posrednem merjenju koncentracije NADPH, ki se ob reakciji porablja. Encim glifosat oksidoreduktaza (GOX) katalizira cepitev vezi C-N, kar vodi do nastanka glioksilata in aminometilfosfonske kisline (AMPA) [3]. Glioksilat reduktaza (GRHPR) nato katalizira redukcijo glioksilata v glikolno kislino, ob čemer se NADPH oksidira v NADP⁺ [4]. Protein iNap na koncu deluje kot senzor za NADPH, saj se ob vezavi tega kofaktorja konformacijsko spremeni in odda fluorescenčni signal [5]. Kadar je v raztopini torej prisoten glifosat, se bo ob njegovi encimski razgradnji NADPH pretvarjal v NADP⁺, kar pa bi lahko zaznali z merjenjem upada fluorescence iNap in tako določili koncentracijo glifosata.

Da bi se izognili alternativnim metabolnim potem in lažnim rezultatom zaradi citosolnega NADPH, so encime želeli pritrditi na zunanjo površino bakterijske celice, tako da bi jih fuzirali z membranskimi proteini. Kot fuzijske partnerje so preizkusili proteine INPNC, BrkA in AIDA.

Eksperiment

Tabela 1: Biokocke za sistem detekcije.

Protein	Opis	INPNC	BrkA	AIDA
GOX	Glifosat oksidoreduktaza iz rastline Echinochloa colona.	BBa_K3332052	BBa_K3332055	BBa_K3332054
GRHPR	Glioksilat reduktaza iz človeških jeter.	BBa_K3332057	BBa_K3332060	BBa_K3332059
iNAP	Fuzija proteinov cpYFP in NADPH vezavne domene proteina REX iz Thermus aquaticus.	BBa_K3332047	BBa_K3332050	BBa_K3332049

V eksperimentu so želeli preizkusiti delovanje proteinov, ko so bili ti pritrjeni na površino celic. V predhodnih eksperimentih so potrdili uspešno izražanje izbranih proteinov na površini celice. Pripravili so biokocke, kjer je bil vsak izmed treh proteinov fuziran na tri različne membranske proteine: INPNC, BrkA ali AIDA (tabela 1). Biokocke so vsebovale konstitutivni promotor J23100, RBS BBa_B0034 in terminator BBa_B0015. Proteine so predstavili na površini E. coli DH5α in jih preizkusili v seriji eksperimentov.

• Suspenziji celic z izraženim GRHPR so dodali glioksilat in NADPH. Koncentracijo NADPH so spremljali z merjenjem OD₃₄₀. Opazili so, da je koncentracija NADPH skozi čas padala, na podlagi česar so sklepali, da encim uspešno katalizira reakcijo. Primerjali so učinkovitost encima z različnimi fuzijskimi partnerji in sklenili, da je bila izmed vseh najučinkovitejša kombinacija INPNC-GRHPR.

• V naslednjem eksperimentu so suspenziji celic z izraženim GOX dodali glifosat, NADPH in topno obliko encima GRHPR. Na podlagi upada OD₃₄₀ so določili, da je GOX uspešno kataliziral reakcijo in vsi fuzijski proteini so bili podobno učinkoviti.

• Zaradi omejenega časa za eksperimente so uspeli preizkusiti le kombinaciji INPNC-iNap in iNap-AIDA. Merili so časovno odvisnost fluorescence (ekscitacija pri 420 nm, emisija pri 528 nm) pri različnih koncentracijah NADPH pokazali odvisnost fluorescence od koncentracije pri obeh fuzijskih proteinih.

• Pripravili so suspenzijo, kjer so hkrati dodali celice z vsakim od treh proteinov (pritrjenih preko INPNC). Suspenziji so dodali glifosat in NADPH ter spremljali fluorescenco skozi čas. V primerjavi s kontrolo brez izraženih proteinov je v suspenziji prišlo do znatnega upada fluorescence, s čimer so potrdili delovanje njihovega sistema.

Razgradnja

Osnovni princip

Poleg sistema za detekcijo glifosata v vzorcu so želeli pripraviti tudi gensko spremenjeno bakterijo E. coli, ki bi lahko glifosat in njegov derivat AMPA v okolju razgradila v neškodljive produkte. Za razliko od pristopa za detekcijo glifosata, bi tokrat njegova razgradnja potekala po alternativni poti, ki temelji na cepitvi vezi C-P. Za tak mehanizem razgradnje so odgovorni encimi, ki so zapisani na operonu phn, ki ga najdemo pri številnih bakterijah, tudi E. coli. Proteini PhnC, D in E predstavljajo sistem za aktivni transport fosfonskih kislin v celico, medtem ko kompleks PhnGHIJK, katerega glavna katalitična komponenta je PhnJ, katalizira cepitev vezi C-P s hkratno hidrolizo ATP. Po odstranitvi fosfitne skupine z glifosata, se sprosti N-metilglicin, ki pa se lahko v celici naprej oksidira do formaldehida in glicina.

Encim PhnO katalizira prenos acetilne skupine iz acetil koencima A na AMPA. Acetiliran AMPA lahko deluje kot substrat za PhnGHIJK, ki ga razgradi do N-metilacetamida. PhnO in PhnGHIJK lahko torej razgrajujejo tako glifosat kot tudi AMPA [6].

Eksperimenti

Tabela 2: Sestavni deli biokocke za degradacijo.

Zapis	Opis
PhnJ	Katalitična podenota C-P liaze iz Enterobacter cloacae K7.
PhnO	Encim za acetilacijo AMPA iz Salmonella enterica.
PhnE1 in PhnE2	Del transportnega sistema za glifosat iz iz Sinorhizobium meliloti 1021.
anti-PhnJ	siRNA za endogen phnJ.
anti-PhnF	siRNA za endogen phnF.

Da bi izboljšali razgradnjo glifosata in AMPA v E. coli so želeli nekatere gene phn nadomestiti s homologi iz drugih organizmov, kjer ta razgradnja poteka učinkoviteje (tabela 2). Vstaviti so želeli gene phnJ iz Enterobacter cloacae K7 [7], phnO iz Salmonella enterica [8] in phnE1/E2 iz Sinorhizobium meliloti 1021 [9]. Hkrati so želeli inhibirati izražanje endognih zapisov za PhnF, ki deluje kot represor za nekatere gene phn [6], in PhnJ, ki bi lahko z rekombninantnim PhnJ tekmoval za podenote kompleksa PhnGHJIK. Kot metodo inhibicije izražanja so izbrali siRNA.

Pripravili so biokocko BBa_K3332099, ki je vsebovala vse potrebne zapise. Izražanje genov za proteine so nadzorovali promotorji J23100 in RBS BBa_B0034, tako da sta imela phnJ in phnO vsak svoj promotor in RBS, phnE1 in phnE2 pa sta bila povezana policistronsko. Uporabili so terminator BBa_B0015. Za siRNA so uporabili promotor J23101 in terminator BBa_J61048, zaporedjem pa so za boljšo stabilnost in učinkovitost dodali še zaporedje OmpA 5' UTR [10] in vezavno mesto za Hfq [11].

S konstruktom, ki je vseboval pripravljeno biokocko, so transformirali E. coli BL21(DE3). Bakterije so gojili v gojišču z glifosatom in po 5 h določili koncentracijo preostalega glifosata v gojišču tako, da so uporabili svoj sistem za detekcijo. Primerjali so konstrukte z različnimi kombinacijami zapisov, vendar je bila najuspešnejša biokocka opisana zgoraj, ki je vsebovala vse zapise hkrati. Medtem ko so bakterije v negativni kontroli po 5 h privzele 8,6 % glifosata iz gojišča, so E. coli z biokocko privzele 43,1 %.

Stikala smrti

Stikalo za sistem detekcije

Stikalo smrti pri sistemu detekcije glifosata bi zagotovilo, da bi gensko spremenjene E. coli odmrle, če bi se sprostile v okolje. Gojišče, v katerem bi potekala detekcija glifosata v vzorcu, bi vsebovalo arabinozo, ki bi inhibirala sintezo citotoksične nukleaze MazF [12]. V primeru, da bi bakterije zapustile to goijšče, bi se mazF lahko izražal in privedel do celične smrti.

Pripravili so preprosto napravo BBa_K3332081, ki deluje kot inverter. Promotor P_BAD nadzoruje izražanje zapisa za cI, promotor P_R pa nadzoruje izražanje mazF. Arabinoza povzroči preklop araC iz represorske v aktivatorsko obliko, kar spodbudi izražanje zapisa za cI, cI pa inhibira transkripcijo mazF. V odsotnosti arabinoze bo araC inhibiral izražanje cI, torej bo transkripcija mazF lahko potekala.

Pripravili so eksperiment, kjer so celice z inverterjem gojili v prisotnosti ali odsotnosti arabinoze. Rast bakterij so določili s štetjem CFU po različnih časih inkubacije. Ob prisotnosti arabinoze niso opazili znatnih sprememb v številu kolonij, medtem ko je pri odsotnosti arabinoze število kolonij izrazito upadlo v roku 8 h.

Stikalo za sistem degradacije

Sistem za degradacijo glifosata bi predvidoma deloval tako, da bi suspenzijo bakterij vnesli neposredno v prst, v kateri želimo odstraniti glifosat. Da bi preprečili nenadzorovano širjenje gensko spremenjenih bakterij, bi stikalo za smrt poskrbelo, da bakterije uspešno razgradijo glifosat, nato pa po opravljeni nalogi odmrejo. Zamislili so si napravo, ki bi ob prisotnosti glifosata zavirala izražanje mazF, v njegovi odsotnosti pa se bi mazF izražal in vodil v smrt.

Biokocka BBa_K3332078 deluje kot inverter. Namesto neposredne detekcije glifosata, so kot merilo njegove prisotnosti uporabili formaldehid, ki je eden od produktov ob razgradnji glifosata. HxlR je transkripcijski faktor, ki ob vezavi formaldehida deluje kot aktivator promotorja P_HCHO [13]. P_HCHO nadzoruje izražanje cI, promotor P_R pa izražanje mazF. Ob prisotnosti formaldehida, bo HxlR aktiviral transkripcijo zapisa za cI, cI pa bo onemogočil izražanje mazF. Kadar pa je formaldehid odsoten, transkripcija cI ne bo potekala in posledično se mazF lahko izraža.

Zaradi omejenega časa za eksperimentalno delo, so utegnili preizkusiti le delovanje posameznih sestavnih delov tega stikala, niso pa uspeli izvesti eksperimenta s celotno biokocko.

Viri

1. S. Singh, V. Kumar, S. Datta, A. B. Wani, D. S. Dhanjal, R. Romero, J. Singh: Glyphosate Uptake, Translocation, Resistance Emergence in Crops, Analytical Monitoring, Toxicity and Degradation: A Review. Environmental Chemistry Letters. Springer May 1, 2020, pp. 663–702.
2. World Health Organization: Glyphosate and AMPA in Drinking-water http://www.who.int/water_sanitation_health/ (pridobljeno 18. 4. 2021).
3. L. Pan, Q. Yu, H. Han, L. Mao, A. Nyporko, L. J. Fan, L. Bai, S. Powles: Aldo-keto reductase metabolizes glyphosate and confers glyphosate resistance in Echinochloa colona. Plant Physiol. 2019, 181(4), str. 1519–1534.
4. G. Rumsby, D. P. Cregeen: Identification and expression of a cDNA for human hydroxypyruvate/glyoxylate reductase. Biochim. Biophys. Acta - Gene Struct. Expr. 1999, 1446(3), str. 383–388.
5. R. Tao, Y. Zhao, H. Chu, A. Wang, J. Zhu, X. Chen, Y. Zou, M. Shi, R. Liu, … Y. Yang: Genetically encoded fluorescent sensors reveal dynamic regulation of NADPH metabolism. Nat. Methods 2017, 14(7), str. 720–728.
6. B. Hove-Jensen, D. L. Zechel, B. Jochimsen: Utilization of Glyphosate as Phosphate Source: Biochemistry and Genetics of Bacterial Carbon-Phosphorus Lyase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2014, 78(1), str. 176–197.
7. Y. V. Kryuchkova, G. L. Burygin, N. E. Gogoleva, Y. V. Gogolev, M. P. Chernyshova, O. E. Makarov, E. E. Fedorov, O. V. Turkovskaya: Isolation and characterization of a glyphosate-degrading rhizosphere strain, Enterobacter cloacae K7. Microbiol. Res. 2014, 169(1), str. 99–105.
8. J. C. Errey, J. S. Blanchard: Functional annotation and kinetic characterization of PhnO from Salmonella enterica. Biochemistry 2006, 45(9), str. 3033–3039.
9. C. M. Liu, P. A. McLean, C. C. Sookdeo, F. C. Cannon: Degradation of the herbicide glyphosate by members of the family Rhizobiaceae. Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57(6), str. 1799–1804.
10. M. J. Hansen, L. ‐H Chen, M. L. S. Fejzo, J. G. Beiasco: The ompA 5′ untranslated region impedes a major pathway for mRNA degradation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 1994, 12(5), str. 707–716.
11. G. M. Cech, A. Szalewska-Palasz, K. Kubiak, A. Malabirade, W. Grange, V. Arluison, G. Wegrzyn: The Escherichia Coli Hfq Protein: An Unattended DNA-Transactions Regulator. Frontiers in Molecular Biosciences. Frontiers Media S.A. July 28, 2016, p. 36.
12. Y. Zhang, J. Zhang, K. P. Hoeflich, M. Ikura, G. Qing, M. Inouye: MazF cleaves cellular mRNAs specifically at ACA to block protein synthesis in Escherichia coli. Mol. Cell 2003, 12(4), str. 913–923.
13. R. Zhu, G. Zhang, M. Jing, Y. Han, J. Li, J. Zhao, Y. Li, P. R. Chen: Genetically encoded formaldehyde sensors inspired by a protein intra-helical crosslinking reaction. Nat. Commun. 2021, 12(1), str. 1–13.