Uporabna vrednost transpozonov za gensko zdravljenje

Uvod

Transpozonski vektorji so postali priljubljena tema na področju genskega zdravljenja, saj bi potencialno lahko zaobšli ovire, ki jih povzročajo virusni vektorji. Trenutno poznamo tri obetavne transpozonske vektorje: Sleeping Beauty (SB), piggyBac (PB) in Tol2. Poleg genskega zapisa, ki želimo, da se vgradi v tarčno celico, morajo ti vektorji vsebovati še genski zapis za transpozazo. Trenutno so s tem mehanizmom uspešno prenesli gene v T celice, matične celice in mezenhimske celice. Vnos je potekal ex vivo, medtem ko vnos in vivo predstavlja več težav, zaradi toksičnosti intrinzične DNA in majhne uspešnosti prenosa.

Vnos virusnih vektorjev je uspešen tako po ex vivo sistemu, kot tudi pri in vivo. Kljub temu, pa lahko povzročijo vnetni oziroma imunski odziv, kar lahko zavira dolgoročno izražanje vnesenih genov. Za posamezne integralne virusne vektorje so zaznali, da lahko sprožijo nastanek levkemije zaradi aktivacije celularne protoonkogeneze.

Da bi preprečili napake, ki se pojavijo pri uporabi virusnih vektorjev se je pričela sinteza ne-virusnih vektorjev. Večinoma gre za plazmide, ki so podvrženi kratkoročnemu delovanju zaradi degradacije in postopnega redčenja vnesene DNA v delečih se tarčnih celicah. To je bil povod za nastanek integracijskega ne-virusnega vektorskega sistema, ki temelji na mobilni DNA ali transpozonih, ki se stabilno integrirajo v kromosome tarčne celice.

Način vnosa transpozonov

Vnos transpozonskega vektorja v tarčno celico mora premostiti ovire kot so intrinzične fiziološke in celularne bariere, kot tudi celična membrana in nestabilnost DNA zaradi degradacije.

Ex vivo

Za in vitro vnos transpozonskih vektorjev v tarčne celice se uporabljajo trije modeli:

DNA-kemijski kompleksi: le-ti se vežejo na površino celice, ki jih endocitira.

Elektroporacija: s pomočjo elektrošokov se v celični membrani ustvarijo reverzibilne pore preko katerih se lahko vstavi vektor v celico. Ta način ni optimalen, saj povzroča visoko smrtnost celic.

Magnetofekcija: s pomočjo magnetnega polja in magnetnih nanodelcev vnesemo gen v tarčno celico.

In vivo

Najbolj preučena sta vnos v jetra in ledvice. Vektorski kompleksi so bili vneseni s pomočjo hidrodinamičnih injekcij, ki vključujejo hitre vnose velikih volumnov DNA raztopin. Rezultati kažejo zmerno ekspresijo genov, ob odstranitvi transpozaze iz kompleksa pa je ta znatno padla. To dokazuje pomembnost vgrajevanja genov v gostiteljski genom.

Ta način vnosa se izkorišča za zdravljenje hemofilije A in B, srpasto celične anemije, diabetesa tipa 1 in drugih. Kljub temu pa ta metoda predstavlja tudi nevarnost razvoja hepatotoksičnosti.

Sleeping Beauty (SB)

Transpozon Sleeping Beauty (SB) spada v naddružino transpozonov Tc1/mariner, ki so razširjeni v mnogo evkariontskih organizmih. Ti transpozoni so bili na začetku utišani, predvsem zaradi kopičenja inaktivacijskih mutacij v transpozaznih genih. Transpozicijsko aktivnost so pokazali šele z rekonstrukcijo transpozaznega gena z 'reverzno evolucijo' iz drugih ribjih transpozonov.

SB transpozon je bil prvotno velik 1,6 kb in je bil sestavljen iz dveh invertnih ponovitev/direktnih ponovitev (ang. “inverted repeats/direct repeats”, IR/DRs), ki obdajata gen, ki kodira 360-aminokislin dolgo SB transpozazo (SBazo). V vsakem IR/DR sta prisotni dve vezavni regiji za transpozazo oz. direktni ponovitvi, obe sta pomembni za prepoznavanje transpozaze. Za razliko od desnega IR/DR, levi IR/DR vsebuje 11 bp dolgo sekvenco DNA podobno 3'-polovici DR, specifično HDR motiv, ki zelo poveča transpozicijo.

Za gensko terapijo so prvoten SB sistem pretvorili v dvokomponenten sistem z ločitvijo dveh IR/DR-jev (ki obdajata željen gen) od SBaznega gena na dva nova plazmida. Ta dva plazmida sta sočasno vnesena v tarčne celice, kjer transpozicija poteče preko mehanizma 'kopiraj-in-prilepi' (tako kot pri nativnem transpozonu). Izražanje SBaze s plazmidi predstavlja tveganje za pretirano integracijo teh plazmidov, ki lahko privede do insercijske onkogeneze. Kot varnejšo alternativo je možno SBazo dostaviti tudi kot mRNA. SBazno mRNA v celico po navadi vstavijo z elektroporacijo. Nedavno so razvili izboljšan pristop prenosa mRNA z retrovirusnimi delci (RMT), ki omogoča prehodno in količinsko nadzorovano izražanje SBaze. Kratkotrajna prisotnost SBaze tako omogoča kratko okno za transpozicijo in hkrati zmanjšuje možnost za pojav insercijske onkogeneze.

Učinkovitost SB transpozicije so poskušali še izboljšati, med drugim tudi z generacijo hiperaktivnih transpozaznih mutantov. To so naredili tako, da so v originalno SBazo (SB10) vgradili skupne aminokisline transpozaz iz različnih organizmov. Eden izmed mutantov je SB100X, ki se od drugih SBaz razlikuje po tem, da je bil generiran in vitro z molekularno evolucijo in selekcijo. Pri uporabi tehnike 'marker rescue assay' ima kar 100-krat večjo učinkovitost v mobilizaciji transpozona kot SB10 in ga imajo za najbolj aktivno SBazo do zdaj.

Hematopoetske matične celice (HSC)

Zaradi zmožnosti samoobnavljanja in diferenciacije v različne limfo-hematopoetske celice, so hematopoetske matične celice (HSC, ang. “hematopoietic stem cells”) obetavne za gensko terapijo. Sprva so za stabilen vnos genov v HSC uporabili SB transpozon zgodnje generacije (SB10); učinkovitost je bila relativno majhna in niso našli nobenih dokazov, ki bi podpirali učinkovito hematopoetično rekonstrukcijo in 'multi-lineage marking' in vivo. To jim je kasneje uspelo v transpozonsko modificiranih CD34⁺ HSC z uporabo SB100X sistema. Pokazali so, da se sposobnost za stabilno dostavo genov v CD34⁺ HSC lahko raztegne tudi na PB sistem, vendar je bil SB100X bolj učinkovit. Da pa bi lahko z gotovostjo rekli, kateri sistem je boljši, bi bila potrebna primerjalna študija še z zadnjo generacijo hyPBaz (ang. “hyper-active PBaze”).

piggyBac

piggyBac (PB) transpozon je bil prvič odkrit in izoliran iz Zeljne sovke. Prvo odkriti PB transpozon ima 2.475 baznih parov in kodira 594 aminokislinskih ostankov dolg transpozazni gen. Tako kot SBaza tudi PBaza vsebuje katalitično domeno z DDE/D motivom, ki interegira z (Mg²⁺) ioni med transpozicijo. C-končno zaporedje PBaze vsebuje cinkov vezavni prst, ki ima ohranjene cisteinske ostanke. Ta vektor uporabi sistem 'cut and paste' oz. izreži in prilepi, kjer PBaza prepozna dva TIR (končno obrnjeno zaporedje) PB transpozona. Za razliko od SB, je prednostno genomsko mesto vstavljanja za PB, TTAA zaporedje. Po vezavi PBaze na transpozon, sledi cepitev 3' konca vektorja, kar ima kot posledico prosto OH skupino na 3' koncu. To omogoča povezavo s TTAA zaporedjem na 5' koncu tako, da nastane lasnična zanka. Transpozonski vektor se po tem sprosti iz genoma in se veže na novo zaporedje TTAA na genomu, kjer transpozaza omogoča cepitev vezi in vstavitev vektorja v genom. Ugotovili so tudi, da ima SB bolj naključno vstavljanje v DNA kot PB, ki favorizira z geni bogate regije in začetnimi mesti transkripcije.

Če želimo popraviti oz. vstaviti gene v DNA potrebujemo mehanizem homologne rekombinacije. Vendar je znano, da ima homologna rekombinacija slabo učinkovitost pri odraslih oz. razvitih celicah, saj te ne vsebujejo mehanizma homologne rekombinacije. Zato je pri odraslih celicah vodilno nehomologno končno združevanje nukleotidov, kar se kaže v pogostih škodljivih mutacijah, ki lahko povzročijo izgubo gena. Pri piggyBac gre za mehanizem, kjer transpozaza ne potrebuje drugih celičnih kofaktorjev za vstavljanje zaporedja v DNA, hkrati pa piggyBac lahko nadzorujemo z uravnavanjem količine injiciranega transpozona. Odkrili so, da je piggyBac trenutno edini transpozonski element, ki po izrezu iz DNA ne pušča odtisa, ki bi lahko dodatno poškodoval zaporedje in povzročil nadaljnje mutacije. Kljub vsem raziskavam, še vedno ostajajo vprašanja, kot na primer: ali je piggyBac dovolj varnostno preverjen za uporabo v genski terapiji in ali bo tarčnost transpozona povečala selektivnost in učinkovitost genske terapije.

Klinična uporaba

Prvi primer ex vivo genske terapije s pomočjo transpozonov je bilo generiranje CAR T celic (celice T z izraženim kimernim antigenskim receptorjem) za imunoterapijo pri pacientih z B-limfoidnimi malignomi. Cilj terapije je bil zmanjšati stopnjo ponovitve bolezni. Uporabili so SB transpozonske vektorje. Vsesplošna stopnja preživetja in stopnja nazadovanja bolezni se je povečala. Prav tako ni bilo prisotnega sindroma sproščanja citokinov, poslabšanja bolezni presadka proti gostitelju ali drugih toksičnosti.

Uporaba transpozonov za gensko zdravljenje ni brez svojih težav. Z vnosom genskega zapisa tvegamo povzročitev insercijske mutageneze. Integracija gena lahko potencialno vodi aktivacijo onkogena ali v prekinitev tumor-supresorskega gena, kar močno poveča verjetnost maligne transformacije. Način, kako bi lahko to preprečili je sinteza modificiranih transpozaz, ki bi na N- in C-koncu vsebovale modificirana DNA-vezavna mesta, kar bi omogočilo specifično vezavo.

Hemofilija B

Pri tej bolezni gre za zmanjšano količino faktorja IX (FIX), ki sodeluje pri strjevanju krvi, posledično imajo bolniki povečano možnost krvavitev. Na miših, ki imajo okvarjen FIX, so uporabili PB transpozon, ki je imel v svoj zapis poleg transpozaze vstavljen tudi promotor za FIX, kar je povzročilo povečano izražanje tega faktorja ter na ta način miši ozdravili hemofilije B. Prišli so tudi do sklepa, da bi z dodatnim izboljšanjem PB lahko omogočili še večjo učinkovitost transpozonov, ki imajo vstavljene daljše gene, kar bi omogočilo tudi zdravljenje hemofilije A, kjer pa gre za zmanjšano izražanje faktorja VIII, ki je tudi pomemben pri strjevanju krvi. V študiji so uporabili več različno spremenjenih transpozonov, s čimer so želeli povečati učinkovitost izražanja gena ter zmanjšati terapevtski odmerek za miši. Ugotovili so, da aktivnost in stabilnost antigena FIX traja več kot 12 mesecev, kar kaže na učinkovito metodo zdravljenja, brez večjih posledic na samo telo. Uporabo transpozonov so tudi analizirali v miših nagnjenih k razvoju hepatičnega karcinoma, vendar niso opazili znakov, ki bi nakazovali na onkogenost PB transpozicije.

Literatura:

1. J. Tipanee, T. VandenDriessche, and M. K. Chuah, “Transposons: Moving Forward from Preclinical Studies to Clinical Trials,” Human Gene Therapy, vol. 28, no. 11, pp. 1087–1104, Nov. 2017, doi: 10.1089/HUM.2017.128.

2. M. di Matteo et al., “Hyperactive PiggyBac transposons for sustained and robust liver-targeted gene therapy,” Molecular Therapy, vol. 22, no. 9, pp. 1614–1624, 2014, doi: 10.1038/MT.2014.131.

3. M. Patel and S. Yang, “Advances in Reprogramming Somatic Cells to Induced Pluripotent Stem Cells,” Stem Cell Reviews and Reports, vol. 6, no. 3, pp. 367–380, 2010, doi: 10.1007/S12015-010-9123-8.

4. L. E. Woodard and M. H. Wilson, “piggyBac-ing models and new therapeutic strategies,” Trends in Biotechnology, vol. 33, no. 9, pp. 525–533, Sep. 2015, doi: 10.1016/J.TIBTECH.2015.06.009.

5. J. Tipanee, Y. C. Chai, T. vanden Driessche, and M. K. Chuah, “Preclinical and clinical advances in transposon-based gene therapy,” Biosci Rep, vol. 37, no. 6, Dec. 2017, doi: 10.1042/BSR20160614.