ELIXIO -Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah

Projekt »ELIXIO- mikrobni konzorcij za proizvodnjo trajnostne arome vijolic« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021, kjer si je skupina prislužila zlato medaljo za svoj projekt. Zasnovala ga je skupina Toulouse_INSA-UPS, ki je želela z uporabo metod sintezne biologije ustvariti trajnosten, okolju prijazen način proizvodnje naravne arome z vonjem po vijolicah.

Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: https://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Description

Avtorica povzetka: Ajda Godec

Problem

Vonj predstavlja med različnimi živalskimi vrstami, tudi med ljudmi, poseben kulturni in socialni fenomen. Prav zaradi tega se molekule, ki sestavljajo mnoge arome, uporabljene v različnih kozmetičnih produktih, predvsem pa bile osnova za razcvet danes ogromne parfumske industrije, ki je leta 2020 dosegla vrednost 32,8 bilijonov ameriških dolarjev, slednja vrednost pa se zdaleč ni končna. Na področju parfumske industrije Francija zavzema pomembno vlogo, ki jo pogosto povezujejo s produkti visoke kvalitete, prestiža in tradicije. Parfume delimo na štiri osnovne olfaktorne skupine, med njimi je tudi cvetlična, ki se nadalje deli v 10 podskupin. Večino teh esenc pridobivamo iz naravnih virov, najpogosteje iz cvetnih listov. Obstaja pa precejšen nabor cvetlic (t.i neme cvetlice), iz katerih je nemogoče pridobiti esenco z industrijsko signifikantnim izkoristkom. V to skupino uvrščamo vijolice, hiacinte, lilije ipd. Zato se v kozmetični in parfumski industriji za posnemanje vonjev teh cvetlic uporabljajo sintetično pridobljene molekule, ki v določenem razmerju dajo želeno vonjavo. Tak način proizvodnje dišavnih molekul je ekološko zelo obremenjujoč, reakcije potekajo pod ostrimi fizikalno-kemijskimi pogoji, izhodiščno molekula pa pogosto predstavlja petrolej. Po drugi strani pa ekstrakcija parfumskega olja iz naravnega materiala zahteva ogromne količine le-tega, uporabo organskih topil ali vode kot topila, in porabo velike količine električne energije. Trg pa kljub temu izkazuje vedno več zanimanja in nudi večjo podporo naravno pridobljenim spojinam. Da bi lahko zadostili tem potrebam in ohranili konkurenčnost vodilna podjetja (npr. Givaudan, International Flavors and Fragrances, Symrise itd) na tem področju kombinirajo uporabo teh metod, vedno bolj pa vključujejo tudi biotehnološke metode pridelave. Vonj po vijolicah opisuje mešanico spojin, med katerimi velja točno določeno razmerje. Najpomembnejše spojine, ki sestavljajo akord so: α- in β-jonon, linalol, v manjši meri pa tudi dihidro-β-jonon. Te molekule uvrščamo v družino terpenov. Akord z bolj zelenimi notami dopolnjujeta (2E,6Z)-nonadienal in (2E,6Z)-nonadienol [1,2].

Cilj

Skupina francoskih študentov se odločila za pripravo mikrobnega konzorcija z indukcijskimi sistemi, s katerimi bodo dosegli proizvodnjo želenega razmerja dveh glavnih tipov spojin (terpeni in aldehidi), ki oblikujejo akord arome vijolic, simbolične cvetlice mesta Tolouse. Vsaka izmed skupin spojin je sintetizirana po ločeni metabolni poti. Tako so kot šasijo uporabili 2 različna organizma (avtotrofni in heterotrofni), v vsakem izmed njih pa bo potekala ločena metabolna pot. Za proizvodnjo terpenov so izbrali kvasovko Saccharomyces cerevisiae, sinteza aldehidov pa bo potekala v cianobakterijah Synechococcus elongatus UTEX 297 CscB+. Cianobakterija je bila gensko spremenjena z namenom, da izloča v gojišče saharozo, ki služi kot vir ogljika za heterotrofno kvasovko Saccharomyces cerevisiae. Takšna proizvodnja ustreza kriterijem trajnostnega in okolju prijaznega načina pridobivanja spojin, saj je osnova za sintezo molekul le CO2. Po drugi strani pa so dišave proizvedene tekom biotehnoloških procesov po regulativah EU in ZDA obravnavane kot naravno pridobljene. Glavni cilj skupine je bil ustvariti biotehnološki projekt za industrijsko pridobivanje spojin, zato se idejo obravnavali tudi iz podjetniške perspektive.

Načrt in izvedba

SINTEZA TERPENOV V S. cerevisiae

Za šasijo je skupina izbrala dobro okarakteriziran organizem kvasovko S. cerevisiae, saj so vrednosti izkoristkov sinteze in hitrosti metabolične poti terpenov pridobljene iz prejšnjih raziskav industrijsko relevantne. Dodatno prednost so videli tudi v enostavni genski manipulaciji. Ker terpeni niso (α- in β-jonon, linalol, dihidro-β-jonon) naravno prisotni v šasijskem organizmu, je skupina najprej identificirala encime, ki sodelujejo v sintetskih poteh. Uporabljeni geni za encime izvirajo iz različnih rastlinskih vrst, ki so v nadaljevanju navedene ob imen encimov. Jononi se v rastlinah sintetizirajo iz likopena. Ta se najprej pretvori v ε- oziroma β-karoten (karotenoid cepitvena dioksigenaza 1 – CCD1- Osmanthus fragrans, Petunia hybrida), nato po drugi encimski pretvorbi nastane α-jonon (likopen ε-ciklaza -LcyE - Latuca sativa) oziroma β-jonon (likopen β -ciklaza – CrtY- Pantoea ananatis); slednjega po dodatni encimski reakciji nastane dihidro-β-jonon (enoat reduktaza- DBR1- Artemisia annua). Linalol sodi v skupino monoterpenoidov, sintezo katalizira encim linalol sintaza, ki pretvarja geranil difosfat v linalol. Gen za linalol sintazo iz Lavandula angustifolia so uporabili, saj je bil že predhodno uporabljen za sintezo linalola v kvasovkah. Da da bi ujeli časovni okvir projekta so uporabili gensko spremenjen sev (yGPP034 ipENZ011 ipENZ078) kvasovke, ki že proizvaja likopen [1,3].

Na osnovi predhodnih raziskav na E.Coli so študentje pripravili genske konstrukte za fuzijske proteine (LycE- OfCCD1-in CRTY- PhCCD1) in s tem poskušali rešiti problem kolokalizacije encima (CCD1) in substrata, ki katalizira hitrost določujočo encimsko reakcijo. Vzporedno so pripravili še konstrukt, kjer sta nastala encima CCD1 in CrtY ločena, CCD1 pa je preko peptidnega sidra vstavljen v membrano. Tak pristop se je v prejšnjih raziskavah izkazal za učinkovitega, pri čemer se je povišala sinteza β-jonona.Za sintezo α- in β-jonona so pripravili 3 različne plazmide (pVIOLETTE za sintezo α-jonona z inducibilnim galaktoznim promotorjem PGAL1 , pFRAMBOISE-fused in pFRAMBOISE-notfused za sintezo β-jonona z inducibilnim PTetO7 in rtTA aktivatorjem). Za sintezo linalola in dihidro-β-jonona pa so ustvarili plazmid pFLEUR; gen za enoat reduktaza je pod kontrolo estradiol inducibilnega promotorja PZ3eV, gen za linalol sintazo pa pod kontrolo Cu-inducibilnega promotorja PCUP1 . S PCR metodo pomnoženi genski konstrukti so bili vstavljeni v integracijske vektorje z uporabo metode In Fusion. Temu je sledila transfekcija v izbran ekspresijski sev. Z metodo PCR na osnovi kolonije kvasovk so preverili uspešnost transfekcije. Temu je sledila nadaljnja izvedba v bioreaktorjih [1,7].

SINTEZA ALDEHIDOV V S. elongatus

Skupina je kot avtotrofni šasijski organizem uporabila Synechococcus elongatus UTEX 2973, zaradi hitre rasti; primerljive z določenimi vrstami kvasovk, učinkovito gensko modifikacijo pa dosežemo z uporabo tristarševske konjugacije z E.Coli[1,4].

Znano je, da mnoge cianobakterije ob stresnih pogoju za zmanjšanje osmotskega stresa kopičijo saharozo. Synechococcus elongatus UTEX 2973 CscB+ je bil gensko spremenjen do te mere, da izraža saharoza/ H+ simporter – CscB+, povišan pa je nivo tudi drugih encimov vključenih v metabolni poti saharoze, kar omogoča izločanje saharoze v odsotnosti stresnih pogojev (visoke konc. NaCl)[1,5].

Synechococcus elongatus je cianobakterija, ki lahko v stresnih pogojih (visoke koncentracije CO₂, intenzivna svetloba), proizvaja nenasičene maščobne kisline, ki so osnova za sintezo α-linolejske kisline, ta pa služi kot prekurzor za sintezo aldehidov, prisotnih v akordu vonja vijolic. Sinteza 2E,6Z)-nonadienal in (2E,6Z)-nonadienol poteka po lipoksigenazni poti, v kateri sta vključena 2 encima lipoksigenaza (LOX), končno encimsko pretvorbo pa izvede encim hiroksiperoksid liaza (HPL). Zapisa za omenjena encima so vstavili v posebej ustvarjen plazmid pCONCOMBRE, ki omogoča integracijo v gostiteljski genom. Za pripravo plazmida so uporabili gen LOX iz Nicotiana benthamiana ter HPL iz Cucumis melo. Nadzorovana ekspresija jej bila zagotovljena preko teofilin inducibilnega ribonukleotidnega stikalamodulatorja v povezavi s Ptrc promotorjem [1,6].

Integracija v genom Synechococcus elongatus je bila dosežena preko izvedbe tristarševske konjugacije z E.Coli, uspešnost integracije je bila preverjena z metodo PCR na osnovi kolonije cianobakterije. Kokultivacija je potekala v bioreaktorjih.

Rezultati in potencialni prenos v industrijo

Rezultati agarozne gelske elektroforeze so pri obeh organizmih potrdili uspešno neodvisno integracijo v genom. Ob indukciji so na petrijevkah dokazali produkcijo jononov in pretvorbo likopena v β-karoten, zgolj prisotnost α-jonona so dodatno potrdili z RP-HPLC analizo. Analiza medija z GC-MS obeh kultur po dosežku stacionarne faze rast, je pokazala le prisotnost α-jonona, β-jonona. Preko testa encimske aktivnosti DBR1 pa so dokazali prisotnost dihidro-β-jonona. Tekom poskusov so prav tako uspeli potrditi, da lahko kvasovke uspevajo v gojišču s saharozo izločeno s strani cianobakterij. Problem potreben optimizacije je predstavljala nezadostna koncentracija saharoze za preživetje kvasovk tekom daljšega časovnem obdobju [1,7].

Izdelava podjetniškega načrta je pokazala, da bi z optimizacijo količine proizvoda za 10-krat lahko dosegli konkurenčni sistem. Okvirna cena produkta se brez optimizacije giblje okoli 4 000 € na 1 kg olja z vonjem po vijolicah[8].

Viri in literatura

[1] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-org https://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Description (Pridobljeno 28.4.2022)

[2] Perfume Market: Industry Trends, Size, Share, Analysis & Forecast 2021-2026 (Pridobljeno 6.7.2021)

[3] Chen X, Shukal S, Zhang C. 2019. Integrating Enzyme and Metabolic Engineering Tools for Enhanced α-Ionone Production. J Agric Food Chem. 67(49):13451–13459. doi:10.1021/acs.jafc.9b00860

[4] Yu J, Liberton M, Cliften P, Head R, Jacobs J, Smith R, Koppenaal D, Brand J, Pakrasi H. 2015. Synechococcus elongatus UTEX 2973, a fast growing cyanobacterial chassis for biosynthesis using light and CO2. Scientific reports. 5:8132. doi:10.1038/srep08132

[5] Lin P-C, Zhang F, Pakrasi HB. 2020. Enhanced production of sucrose in the fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Scientific Reports. 10(1):390. doi:10.1038/s41598-019-57319-5.

[6] Nakahira Y, Ogawa A, Asano H, Oyama T, Tozawa Y. 2013. Theophylline-dependent riboswitch as a novel genetic tool for strict regulation of protein expression in Cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942. Plant Cell Physiol. 54(10):1724–1735. doi:10.1093/pcp/pct115.

[7] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-Results orghttps://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Results#a4 (Pridobljeno 28.4.2022)

[8] Team:Tolouse INSA-UPS-2021-igem-Enterpreneurship orghttps://2021.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/ Entrepreneurship (Pridobljeno 28.4.2022)