PRYSM - s

Projekt s svetlobo regulirane kvasovke je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 in je bil nagrajen z drugim mestom v kategoriji najboljši proizvodni projekt. Sistem je zasnovala skupina NUS Singapore, ki je želela proizvesti poceni biopesticid s pomočjo kvasovk. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: Team: NUS_Singapore

Uvod

Ekipa NUS je idejo za projekt dobila, ko je eden od članov delal pri agrotehnološkem start-upu in videl kakšen problem predstavljajo škodljivci. Singapur ima majhno obdelovalno področje, ki ne zadostuje za potrebe množičnega prebivalstva, zato se močno zanašajo na uvoz. Poslužujejo se vertikalnega kmetijstva, ki omogoča 20x večji donos kot tradicionalno horizontalno kmetijstvo, vendar se pri takem načinu kmetovanja, škodljivci in bolezni hitreje širijo skozi gosto populacijo rastlin. Zato so se v NUS ekipi lotili vzgajanja kvasovk v odprtem biorektorju, ki bi proizvajale poceni biopesticid.

Konstrukcijske odločitve

Človeški beta defenzin (HBD2)

Defenzini spadajo v kategorijo protimikrobnih peptidov (AMP), ki imajo neencimski inhibitorni učinek na širok spekter mikroorganizmov. Zaradi njihovega pozitivnega naboja peptidi elektrostatsko interagirajo z negativno nabitimi komponentami membrane mikrobnih celic (npr. fosfolipidi), kar poveča prepustnost membrane in sčasoma vodi do celične smrti. V človeškem telesu je to nativni peptid, zaradi česar je izjemno varen za ljudi.

Saccharomycies cerevisiae

Se močno uporablja v bioproizvodnji in živilski industriji, zato je nedvomno najvarnejša možnost za uporabo v kmetijstvu. Je tudi dobro okarakterizirana pri proizvodnji beljakovin in genetskem urejanju, prav tako pa prejšnje uporabe dokazujejo uspešno proizvodnjo in visoke donose človeškega beta defenzina z uporabo te šasije.

Flokulacija

Po fermentaciji bo kvas agregiral in potonil na dno soda. To se zgodi zaradi izločanja proteina Flo1, ki je običajno neaktiven v laboratorijskih in industrijskih kvasovkah. Na površini kvasovk se veže na ostanke manoze v celični steni drugih kvasovk, kar povzroči agregacijo. Flokulacija omogoča enostavno odstranitev celic, je cenejša kot običajne metode ločevanja trdnih in tekočih snovi, kot so filtracija, centrifugiranje ali sedimentacija, omejila pa bi tudi količino gensko spremenjenih organizmov, ki bi lahko končali v našem izdelku in tako povečali biološko varnost.

Optogenetika

Optogenetika je uporaba svetlobe za nadzor genske ekspresije, običajno z manipulacijo beljakovin, ki spremenijo svojo vezavo v prisotnosti določene valovne dolžine svetlobe. Tako je mogoče uporabiti različne barve svetlobe za vklop in izklop določenih genetskih vezij. Zaradi časovne pomembnosti izražanja proteinov, so v kvasovkah uvedli dvokanalni optogenetski sistem – rdeča svetloba je aktivirala izražanje človeškega beta defenzina, modra svetloba pa ekspresijo gena Flo1. Svetlobo so namesto kemičnih induktorjev uporabili ker:

1. Je veliko ceneje

2. Upravljanje svetlobe je lahko avtomatizirano

3. Manj citotoksičnosti/varnosti

4. Minimalen vpliv na celično presnovo, zato ne ovira rasti ali proizvodnje celic

Rdeča svetloba

Kanal rdeče luči je zasnovan na podlagi razcepljenih proteinov:

1. Prvi protein je fuzija med SynTALE DNA vezavno domeno in PhyB domeno iz rastline Arabidopsis thaliana

2. Drugi je zlitje med domeno PIF3 in aktivacijsko domeno VP64

3. Sintetični promotor je sestavljen iz okrnjenega promotorja CYC1, vzetega iz nativnega genoma kvasovk, pri čemer je aktivacijsko zaporedje navzgor zamenjano z DNA zaporedjem, ki je tarča SynTALE DNA vezavne domene.

Vezavna domena SynTALE DNA se bo torej vezala navzgor od okrnjenega promotorja CYC1, v prisotnosti rdeče svetlobe bodo nevezani fuzijski proteini PIF3 VP64 tvorili kompleks s PhyB, kar bo pripeljalo aktivacijske domene v bližino jedrnega promotorja in povzročilo transkripcijo. Ker pa to interakcijo fascilitira kromoforni fitokromobilin, ki se ne sintetizira v kvasovkah, samo izražanje razcepljenih proteinov ne zadostuje uporabo sistema rdeče luči. Izraziti se morata še dva dodatna gena gena za sintetezo fitokromobilina in vivio. Heterologna hem oksidaza (HY1) iz A.thaniliana in bilin reduktaza (PcyA) iz Synechocystis sp. tvorita kromoform, ki lahko zdaj v celoti aktivira Jub1.1 ob prisotnosti rdeče svetlobe. Rdeča svetloba bo vklopila šele, ko bo celična kultura narasla na znatno biomaso, da se bo izničilo negativne učinke, ki bi jih HBD lahko imel na rast celic, saj je lahko citotoksičen za glive in pri konstitutivnem izražanju, negativno vpliva na rast kvasovk in dolgoročno zmanjša donos. Na ta način pridobijo največje število celic pred začetkom proizvodnje človeškega beta defenzina.

Modra svetloba

Kanal modre svetlobe je sestavljen je iz fuzije proteina EL222 in NLS ter VP16 aktivacijske domene. V temi so proteini EL222 ena sama podenota, ob izpostavljenosti modri svetlobi pa podenote EL222 spremenijo svojo konformacijo in izpostavijo LOV (light-oxygen-voltage-sensing domain) in helix turn helix domeno. To jim omogoča tvorbo homodimerov, ki se vežejo na ciljno zaporedje C120 in približajo aktivacijsko domeno, da poteče transkripcija. Modro svetlobo so uporabili za nadzor flokulacije, da se je protein Flo1 začel proizvajati in izražati le po proizvodnji zadostne količine človeškega beta defenzina.

Izdelava optogenetskega ohišja za kvasovke

Sintetični promotorji

Dvokanalni sistem temelji na treh sintetičnih promotorjih, ki so jih razvili sami, in enem promotorju iz PhiReX sistema.

• Promotor modre svetlobe 3C120-CYCp-LacO je sestavljen iz okrnjenega promotorja CYC1, pred katerim so tri ponovitve C120 (vezna mesta za EL222), navzdol je zaporedje lacO. Dimeri EL222 aktivirajo promotor, proizvodnja LacI pa ga inhibira. 3C120-CYCp je različica tega promotorja brez lacO zaporedja.

• Tet-represivni promotor PGK1-tetO je fuzijski promotor iz kvasovkinega promotorja PGK1 in zaporedja tetO, združenima navdol od TATA škatle. Promotor je transkripcijsko aktiven, represira ga prisotnost TetR.

• Promotor Jub1.1 vsebuje 4 zaporedja Jub1.1, ki so tarče proteina SynTALE in približajo fuzijski protein PIF3-VP64 v neposredno bližino okrnjenega promotorja CYC1, ko sta SynTALE -PhyB in PIF3-VP64 izpostavljena svetlobi.

• pAND je fuzija Jub1.1 zaporedij in okrnjenega promotorja CYC1, navzdol pa se nahaja lacO zaporedje, ki se aktivira pri rdeči svetlobi na enak način kot promotor Jub1.1. Ob nastanku lacI, ostane promotor neaktiven.

Napajalno vezje

Za povečanje izražanja promotorjev modre svetlobe so naredili zanko, kjer aktivacija EL222 vodi do povečane ekspresije EL222. Ta pozitivna povratna zanka preusmeri presnovni tok kvasovk proti 3C120-CYCp, ko je prisotna modra svetloba.

Stikalo za uničenje

Stikalo za uničenje je povezano s promotorjem pAND, zato ga je mogoče aktivirati le ob prisotnosti modre in rdeča svetlobe. V prisotnosti samo modre svetlobe je LacI, ki zaustavlja transkripcijo lacO, inhibiran, manjka pa aktivacija pAND za začetek transkripcije nukleaze A. V prisotnosti samo rdeče svetlobe se zaporedja Jub1.1 v pAND aktivirajo, vendar je transkripcija inhibirana z LacI. Šele ob prisotnosti modre in rdeče svetlobe, se pAND aktivira, LacO pa ni več inhibiran s LacI in lahko poteče transkripcija NucA.

Izboljšave

Delali so na zmanjšanju puščanja promotorja in povečanju ekspresije. Za zmanjšanje puščanja so najprej uvedli primarni represor LacI, tako da so vnesli lac operon navzdol od TATA škatle, promotor je bil tako minimano aktiven v temi, polno aktiven pa v prisotnosti modre svetlobe in IPTG. Sekundarni represor je moral povezati LacI z modro svetlobo tako, da je ob prisotnosti svetlobe proizvodnja LacI zaustavljena, posledično pa je 3C120-CYC-LacO aktiven. Kot najboljša možnost se je izkazala uvedba TetO zaporedja in TetR gena pod kontrolo C120-CYC, ki bi v modri svetlobi induciral ekspresijo TetR in utišal TetO mesto. Za povečanje ekspresije so najprej zamenjali gojišče, saj je oranžna barva YPD medija motila prodiranje modre svetlobe, zato so oblikovali nove plazmide, ki so jih lahko vzgajali v prozornem YNV gojišču. Z uvedbo pozitivne povratne zanke so povečali ekspresijo EL222, vplivali pa so tudi na povečano flokulacijo, saj so imele celice s tako zanko hitrejšo sedimentacjisko kinetiko prav tako pa se je tudi večja celična masa trajno flokulirala.

Rezultati

Izločanje beljakovin

Kot signalni peptid so izbrali mfa, ki je dobro okarakteriziran v S.cerevisiae, kot biopesticid pa so najprej izbrali laktoferin, ki dobro zavira rast pepelnate plesni, ki je bila takrat glavni škodljivec, vendar proizvodnja v S.cerevisiae ni bila uspešna. Zaradi časovne omejenosti so se usmerili v iskanje drugega primernega biopesticida in izbrali HBD2, ki se je tudi uspešno izražal.

Flokulacija

Flokulacijo kodira gen FLO1, ki ga najdemo v genomu S.cerevisiae. Gen FLO1 je bil neposredno pomnožen iz genoma in izražen pod inducibilnim promotorjem GAL1p. Gojenje v mediju galaktoze je pokazalo jasno ločitev v trdno fazo.

Nukleaza

Za uvedbo biološke varnosti je bilo treba razviti stikalo za uničenje. Del BBa_K1159105 je bil izbran kot stikalo za ubijanje, saj je deloval kot endonukleaza in tako ne le preprečil, da bi živi organizmi pobegnili iz bioreaktorja, ampak je tudi uničil modificirano DNK, kar je zmanjšalo možnost horizontalnega prenosa genov. Zaradi prešibkega delovanja so na N-konec dodali NLS, količina NucA, ki se je prenesla v jedro se je povečala, posledično se je povečala tudi umrljivost.

Zaključek

Z uporabo računalniških modelov so predlagali še nekaj rešitev, ki so pomagale izboljšati sistem:

1. Uvedba 3 ponovitev domene C120 je povečala občutljivost inducibilnega promotorja in tako izboljšala ekspresijo

2. Z ločenim delom na sistemu modre svetlobe in flokulaciji, nato pa združevanjem modelov lahko uporabnikom dajo predviden čas zbiranja želenega biopesticida, po vklopu modre svetlobe v bioreaktorju

Proizvodnja biopesticida iz kvasovk se je izkazala za uspešno. Sistem implementira več transkripcijskih faktorjev v en sam sev kvasovk, gene za izražanje pa je mogoče enostavno zamenjati.

Viri

[1] “Team:SZU-CHINA - 2021.igem.org.” [Online]. Available: https://2021.igem.org/Team:NUS_Singapore

[2] Cipáková I, Hostinová E. Production of the human-beta-defensin using Saccharomyces cerevisiae as a host. Protein Pept Lett. 2005, 12(6), 551-554.

[3] Soares, E. Flocculation in Saccharomyces cerevisiae: a review. Journal of Applied Microbiology. 2011, 110, 1-18.

[4] Bony M, Thines-Sempoux D, Barre P, Blondin B. Localization and cell surface anchoring of the Saccharomyces cerevisiae flocculation protein Flo1p. J Bacteriol. 1997, 179(15), 4929-4936.

[5] Hochrein, L., Machens, F., Messerschmidt, K., & Mueller-Roeber, B. PhiReX: a programmable and red light-regulated protein expression switch for yeast. Nucleic acids research. 2017, 45(15), 9193–9205.