Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz Rhodosporidium toruloides

Povzeto po članku: X. Guo, Z. Bai, Y. Zhang, H. Zhao, S. Shi: Mining and application of constitutive promoters from Rhodosporidium toruloides. AMB Express 2023, 13, 1–12.

Uvod

Rhodosporidium toruloides je kvasovka rdeče barve, ki sodi med oljnate mikroorganizme. Za njih je značilno, da lipidi predstavljajo vsaj 20% njihove suhe mase. R. toruloides lahko v večjih količinah sintetizira lipide, maščobne alkohole, metile in etilne estre maščobnih kislin in karotenoidov. [1]

Zaradi zmožnosti biosinteze raznovrstnih produktov, visoke odpornosti na stres in rasti v različnih gojiščih je perspektiven kandidat za uporabo v industriji. [2] Uporaba kvasovke za biosintezo raznovrstnih produktov bi bilo iz ekonomskega stališča tudi ugodno, zaradi zmožnosti pretvorbe lignocelulozne biomase v biogoriva. [3] Za industrijsko aplikacijo je potrebna optimizacija metabolne poti, za kar je nujno predhodno poznavanje večjega nabora različno močnih konstitutivnih promotorjev. Za nemodelni organizem je bilo do sedaj odkritih 31 promotorjev, ki so v večini povezani s hišnimi geni ali geni, ki regulirajo akumulacijo lipidov. Eden izmed prvih karakteriziranih močnih konstitutivnih promotorjev je bil PGPD1, ki je promotor gena za gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazo. Moči ostalih do sedaj znanih promotorjev so bile določene relativno na moč PGPD1 in se gibljejo med 0,2-11-kratno močjo PGPD1. [1]

S pomočjo poznavanja večjega števila promotorjev in njihovih značilnosti je optimizacija biosinteznih poti maščobnih kislin lažja. V rastlinah poteka pretvorba stearinske kisline (nasičene maščobne kisline z 18 C atomi) v linolno kislino v dveh korakih z uvedbo dveh dvojnih vezi. Prvi encim je Δ9 desaturaza, ki med 9. in 10. C-atom v stearinski kislini uvede dvojno vez, pri čemer nastane oleinska kislina. Drugi encim Δ12 desaturaza pa uvede dvojno vez med 12. in 13. C atom, da nastane linolna kislina. [4] Za optimizacijo poti linolne kisline je torej potrebno optimizirati izražanje genov FAD9 in FAD12 za desaturazi.

Iskanje in karakterizacija promotorjev

Gojenje kvasovk in analiza transkriptoma

R. toruloides so gojili v različnih gojiščih za gojenje kvasovk kot so YPD (yeast peptone dextrose), YPX (yeast peptone xylose), popolno gojišče in minimalno gojišče. Naredili so analizo transkriptoma z določanjem nukleotidnega zaporedja RNA kvasovk, ki so rasle v različnih medijih, in na podlagi najpogosteje izraženih genov določili potencialne kandidate za močne konstitutivne promotorje. [1]

Priprava plazmidov za karakterizacijo promotorjev

Za analizo moči promotorjev so pripravili plazmide pKOCAR2 s kaseto reporterskega gena EGFP, ki je vsebovala zapise za različne promotorje, EGFP in terminator 35S. Kvasovke so transformirali z metodo z Agrobacterium tumefaciens posedovanje transformacije (ATMT), pri kateri je prišlo do vstavitve kasete v CAR2 gen preko homolognih regij. Pri vstavljanju kasete v CAR2 je prišlo do delecije gena za karoten ciklazo, zaradi česar so bile kolonije bele barve. Transformiranih celicam so izmerili fluorescenco v eksponentni in stacionarni fazi rasti in jo normalizirali na število celic. [1]

Rezultati

Z analizo transkriptoma R. toruloides v 4 gojiščih in 2 fazah rasti (8 različnih pogojev) so odkrili povprečno 8233 transkriptov pri vsakem od pogojev rasti. Na podlagi 15 najpogosteje izraženih genov pri vsakem pogoju so določili 49 potencialno močnih promotorjev. Kot pozitivno kontrolo so uporabili do sedaj že poznane močne konstitutivne promotorje iz R. toruloides - GDP1 (gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza), FAS1 (beta podenota sintaze maščobnih kislin) in TPI (trioza fosfat izomeraza).

Po transformaciji so pod mikroskopom kvalitativno ocenili seve, ki so imeli močno fluorescenco. Poleg kontrolnih sevov je 31 od 49 sevov izražalo močno fluorescenco. Vsem sevom pri različnih pogojih so nato določili relativno fluorescenco glede na fluorescenco promotorja PGPD1, ki je bila 0,1-19,0-kratna. Z določanjem nukleotidnega zaporedja promotorjem so odkrili s pirimidini bogati regiji na mestih -90 in -10, ki sta bili skupni vsem promotorjem. Kot zelo močna promotorja pri vseh pogojih sta se izkazala RT12 in RT14, medtem ko je bila moč nekaterih drugih promotorjev kot sta RT2 in RT5 zelo odvisna od tipa gojišča. Opažena je bila tudi povezava med fazo rasti in močjo promotorja. Promotorja RT12 ter RT14 sta bila močnejša v eksponentni fazi rasti, medtem ko sta bila promotorja RT2 ter RT5 močnejša v stacionarni fazi rasti. [1]

Optimizacija biosintezne poti linolne kisline

Priprava plazmidov in analiza hitrosti rasti in sinteze maščobnih kislin

Za optimizacijo sintezne poti linolne kisline so uporabili promotorje RT12, RT14, RT46 in GPD1, gena FAD9 in FAD12, ki zapisujeta za Δ9 in Δ12 desaturazo, in terminatorja SV40 in 35S. Pripravili so vektorje pKOCAR2, ki so vsebovali omenjena gena pod različnimi kombinacijami promotorjev. Transformirane kvasovke so gojili v različnih gojiščih in z merjenjem OD600 določili hitrost rasti. Količino proizvedenih lipidov in metilnih estrov maščobnih kislin so določili s plinsko kromatografijo sklopljeno z masno spektrometrijo (GC-MS). Za določanje količine sladkorjev v gojišču z dodanim hidrolizatom koruznih storžev so uporabili tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC).

Rezultati

Za optimizacijo biosintezne poti linolne kisline so uporabili zelo močna promotorja RT12 in RT14 in močna promotorja RT46 in GPD1. Promotorji so uravnavali izražanje genov za Δ9 in Δ12 desaturazo. Pri spremljanju hitrosti rasti in sintezi maščobnih kislin so opazili, da so vsi transformirani sevi rastli malo hitreje in proizvajali več linolne kisline kot starševski sev R. toruloides NCYC 1585. Za najboljši sev se je izkazal sev 56, ki je vseboval promotorja RT12 in R14. Sinteza linolne kisline se je povečala za 2,13× glede na starševski sev v gojišču YPD (iz 164,3 mg/L na 350,3 mg/L) in 3,14× (iz 79,08 mg/L na 248,5 mg/L) v minimalnem gojišču.

Rast in sintezo maščobnih kislin so preizkusili tudi v gojišču s hidrolizatom koruznih storžev. Hidrolizat predstavlja poceni vir sladkorjev kot so ksiloza, glukoza in arabinoza. Vsi sevi so dobro rastli v omenjenem gojišču, za najboljšega pa se je izkazal sev 59, ki je vseboval gena za desaturazi pod dvema promotorjema RT46. Domneva se, da je RT46 povezan z boljšim izražanjem genov v gojišču, kjer je prisotnih več vrst sladkorjev.

Vsi sevi so bili sposobni porabiti več kot 80% prisotnih sladkorjev v 30 urah rasti. V hidrolizatu je bila koncentracija ksiloze višja od glukoze, vendar se je prva porabila ravno glukoza.

Zaključek

R. toruloides sodi med nemodelne organizme, ki so sposobni shraniti lipide v količinah do 70% suhe mase. Do sedaj je bilo v kvasovki uspešno sintetiziranih že več maščobnih kislin in etilnih estrov maščobnih kislin z uvedbo različnih metabolnih poti. Z identifikacijo in karakterizacijo novih promotorjev je bila uspešno optimizirana biosintezna pot linolne kisline v različnih gojiščih.

Z merjenjem fluorescence EGFP je bila določena moč novih 31 promotorjev, ki variira med 0,1 do 19,0-kratno močjo promotorja GPD1. Najšibkejši promotor je RT45 v minimalnem gojišču, najmočnejši pa je RT5 v gojišču YPX. Omenjen promotor se je v tem naboru izkazal kot srednje močen. Najmočnejša promotorja pri različnih pogojih sta RT12 in RT14. Izbrani promotorji so povezani z raznovrstnimi geni za izražanje metabolnih encimov, transporterjev, proteinov povezanih s translacijo in hišnih proteinov. Do sedaj je bilo opravljenih že več raziskav za identifikacijo močnih konstitutivnih promotorjev v R. toruloides. Nekateri promotorji v tej in drugih raziskavah so asociirani z enakimi geni, vendar nukleotidno zaporedje promotorjev ni enako, zaradi različno definiranih promotorskih regij.

Pričakovano je, da bo z novo identificiranimi promotorji, ki imajo širši red velikosti moči, optimizacija ostalih sinteznih poti v nadaljnje lažja.