MonChassis

Svet se trenutno sooča z velikimi globalnimi težavami, zato je potrebno iskanje novih, trajnostnih rešitev. Poseben razred z obetajočimi aplikacijami so monoterpenoidi. Monoterpenoidi imajo širok spekter uporabe, na primer v kozmetiki, medicini, zatiranju škodljivcev, živilski industriji in biogorivih. Toda obsežna uporaba monoterpenoidov je redka zaradi cene in časa, ki so potrebni za njihovo pripravo. Skupina iGem iz Muenstera je leta 2022 raziskovala možnost njihove sinteze v kvasovkah. Predstavitev projekta je dostopna na sledeči povezavi: https://2022.igem.wiki/wwu-muenster/.

PROIZVODNJA MONOTERPENOIDOV

Ekstrakcija iz rastlin

Primarni vir monoterpenoidov so rastline, kjer imajo pomembno vlogo v številnih fizioloških procesih. Rastlinska eterična olja vsebujejo več kot 80 % monoterpenoidov, vendar ima ekstrakcija eteričnih olj iz rastlin nizek izkoristek. Poleg tega je zaradi kompleksnosti eteričnih olj čiščenje posameznih monoterpenoidov stroškovno obsežno, naporno in neučinkovito. Sestava je namreč odvisna od pogojev rasti rastlin in njihovega shranjevanja <ref>[1]</ref>.

Kemijska sinteza:

Kemijska sinteza je bolj zanesljiva možnost za proizvajanje monoterpenov. Priprava enostavnih molekul je možna, medtem ko se cena in potrebna energija večata z večanjem kompleksnosti molekule. Poleg tega pe je kemijska sinteza okolju neprijazna zaradi onesnažujočih topil in katalizatorjev ter je včasih odvisna od neobnovljivih virov<ref>[2]</ref>.

Proizvodnja v bakterijah

Bakterije so pogosto prva izbira za proizvodnjo kemikalij in vivo, saj je taka proizvodnja hitra in poceni. Za proizvodnjo monoterpenoidov pa ima delo z bakterijami več pomanjkljivosti. Prvič, obstaja pomanjkanje prekurzorja geranil difosfata (GPP) v bakterijskem gostitelju. Za povečanje sinteze je treba celotno pot mevalonata preoblikovati v bakterije<ref>[3]</ref>. Drugič, koraki monoterpenoidne biosinteze zahtevajo funkcionalno izražanje CYP, kar je izziv pri bakterijah<ref>[4]</ref>. Tretjič, tudi če se vsi heterologni geni lahko funkcionalno izrazijo, proizvodnja monoterpenoidov z bakterijami morda ne bo učinkovita. Kopičenje prekurzorjev vodi do zmanjšane rasti celic, različni monoterpenoidi pa imajo toksične učinke na bakterije z motnjami v celični membrani<ref>[5]</ref>.

Proizvodnja v kvasovkah

Kvasovke predstavljajo privlačno alternativo za proizvodnjo monoterpenoidov. Kvasovke imajo pot endogenega mevalonata (MVA), pri kateri se GPP, predhodnik vseh monoterpenoidov, hitro pretvori v farnezil difosfat (FPP)<ref>[5]</ref>. Druga omejitev pri proizvodnji monoterpenoidov s kvasom je toksičnost proizvoda, ki lahko omeji količino proizvodnje<ref>[6]</ref>.

MON CHASSIS

MonChassis je prilagodljiva platforma na osnovi kvasovk za obsežno proizvodnjo monoterpenoidov. Temelji na pripravi terpenskih prekurzorjev v kvasovkah z uporabo sinteznobiološkega inženiringa ter s katalizo v končne produkte z brezceličnim sistemov encima CYP. Raziskovana je bila proizvodnja v Saccharomyces cerevisiae in Yarrowia lipolytica s spremembo moči promotorjev ključnih encimov in uvedbo novih zapisov<ref>[2]</ref>.

Monoterpenoide se lahko učinkovito sintetizira z modifikacijo mevalonantne poti kvasovk<ref>[5]</ref>. Da bi povečali presnovni tok poti MVA, je bilo identificiranih in optimiziranih več pomembnih encimov, ki omejujejo hitrost poti. Z uvedbo dodatnih heterolognih genov in utišanjem endogenih genov je možno optimizirati proizvodnjo monoterpenoidov. Glavni cilj je bil povečati proizvodnjo geranil difosfata (GPP) v Saccharomyces cerevisiae, saj deluje kot bistveni prekurzor za sintezo monoterpenoidov, kot je α-pinen. Med temi sta najbolj omejujoča ERG13 in 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A (tHMGR). Če gena za ta encima prekomerno izrazimo, se poveča tudi proizvodnja prekurzorjev monoterpenoidov.
Dodatna skupna omejitev modelov je sinteza ergosterola iz GPP, iz katerega nastajajo tudi prekurzorji monoterpenoidov. Ker je sinteza ergosterola nujna za celično rast, bodo modeli, ki temeljijo na endogeni poti MVA kvasovk, vedno omejeni v svojih donosih. Zaradi tega je bila preverjena učinkovitost proizvodnje tudi v peroksisomih, ker bi tako bila proizvodnja monoterpenoidov in ergosterola ločena. Peroksisomi predstavljajo zagotavljajo ugodne fiziološke pogoje za sintezo prekurzorjev monoterpenoidov<ref>[7]</ref>. Usmerjanje encimov v peroksisome je mogoče zlahka doseči z dodajanjem tripeptida C-terminalnega peroksisomskega ciljnega signala-1 (PTS1)<ref>[8]</ref>. Skupaj se je preverjalo učinkovitost proizvodnje v citosolu in v peroksisomu bodisi v organizmih Saccharomyces cerevisiae in Yarrowia lipolytica.
MonChassis je sestavljena iz dveh komponent: sestava prekurzorjev terpenov v kvasovkah in in vitro kataliza spremembe prekurzerjev v monoterpenoide. V ta namen MonChassis uporablja samozasnovan bioreaktor za encimsko elektrosintezo (BREES) in modificirano citokrom P450 monooksigenazo BM3. Kot dokaz delovanja je potekla kataliza reakcije iz α-pinena v verbenon.

BREES

Najlažji način za spopadanje s toksičnostjo produktov je uporaba brezceličnih sistemov. Tradicionalna biokataliza brez celic zahteva dodajanje kofaktorjev, kot je NADPH, ki zvišuje stroške za obsežne aplikacije. Da bi bila komponenta MonChassis in vitro uporabna v industrijskem obsegu je bilo potrebno razviti poceni alternativa. Zato je bil sestavljen BREES, bioreaktor za encimsko elektrosintezo. BM3, znan tudi kot citokrom P450 BM3 ali CYP102A1, je bakterijski encim citokroma P450, pridobljen iz Bacillus megaterium. Je vsestranski encim z aktivnostmi monooksigenaze in hidroksilaze maščobnih kislin. Čeprav ni neposredno vpleten v proizvodnjo terpenoidov, so bili BM3 in njegove različice uporabljeni kot biokatalizatorji za modificiranje terpenoidnih spojin. Raziskovalci so izdelali BM3 in druge encime citokroma P450 za uvedbo hidroksilnih skupin, epoksidov ali drugih funkcionalnih skupin v terpenoidne molekule, kar omogoča katalizo α-pinena v končne monoterpenoide. Modificiran encim ima dodan peptidni povezovalec, ki lahko imobilizira encim na elektrodo iz indijevega kositrovega oksida in omogoči neposreden prenos elektronov z elektrode na encim<ref>[9]</ref>. Encim lahko uporablja elektrone neposredno iz električne energije in ne zahteva dovajanja drugih kofaktorjev. V kombinaciji z inženirskimi sevi kvasovk MonChassis BREES omogoča hitro, prilagodljivo in obsežno proizvodnjo monoterpenoidov.

STRATEGIJA KLONIRANJA

Po uradnih pravilih iGEM je bilo splošno kloniranje izvedeno v skladu z modularnim sistemom kloniranja RFC1000 (MoClo). Sistem MoClo se opira na restrikcijske encime tipa IIS, ki cepijo DNA tako, da nastanejo lepljivi konci. Ustvarjanje različnih koncev pri različnih fragmentih omogoča učinkovito sestavljanje več fragmentov DNA v eni preprosti reakciji ligacije. Primerna zasnova koncev omogoča, da se fragmenti sestavljajo samo v vnaprej določenem vrstnem redu. Vsi geni so bili pomnoženi z začetno verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo specifičnih začetnih oligonukleotidov z ustreznimi pritrjenimi konci.
Končni zapisi so bil sestavljeni z metodo Golden Gate v vektor pSB1C00. V vektor so dovajali zapis transkripcijskih enot, ki so ga sestavljali promotorji, kodirno zaporedje in terminator. Z uporabo različnih promotorjev je bila mogoča sprememba ravni izražanja genov. Uspešno integracijo so preverili s selekcijo transformiranih kolonij, saj so celice konstitutivno izražale rdeči fluorescenčni protein (mRFP1).

Za transformacijo kvasovk sta bili uporabljeni metodi Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-assotiated protein 9 (CRISPR-Cas9) in uporaba ekstrakromosomskih prenosljivih vektorjev. Vsak vektor vsebuje enega od štirih različnih selekcijskih markerjev (HIS3, TRP1, LEU2 ali URA3) za genomsko integracijo.

Proizvodnja v citosolu Saccharomyces cerevisiae

Mevalonatna pot Saccharomyces cerevisiae so spremenili z metodo Golden Gate Assembly in ustavili heterolognega gena PptAPS ter povečali izražanje endogenih genov ScERG13 ali SctHMGR.
Genske spremembe so temlejile na sistemu CRISPR-Cas9. Z namenom povečanja koncentracije mevalonata sta bila utišana ScROX1 in ScERG13 ter SctHMGR uravnavan z močnim promotorjem. Izločitev ScROX1 je bila ugodna za povečanje koncentracije mevalonata, saj zavira encime v MVA<ref>[10]</ref>. Pri drugi varianti sta bila uvedena gena GgmFPS144 iz Gallus gallus in AgtGPPS2 iz Abies grandis, da bi povečali koncentracijo geranil difosfata (GPP). Izločitev ScERG20 in vstavljanje GgmFPS144 sta bila potrebna za zaviranje reakcije GPP v (FPP)<ref>[11]</ref>. Uvedba heterologne α-pinen sintaze (PptAPS) iz Pinus ponderosa je povečala proizvodnjo α-pinena v citosolu.
Analiza z GC-MS je potrdila prisotnost α-pinena v lizatu.

Proizvodnja v peroksisomih Saccharomyces cerevisiae

Poleg citosola je peroksisom postal obetavna tarča za presnovni inženiring, saj naj bi njegove fiziološke lastnosti, kot je razpoložljivost substrata, znatno izboljšale sintezo produkta<ref>[7]</ref>.
Ker se metabolizem mevalonata ne pojavlja naravno v peroksisomih<ref>[12]</ref>, je bilo treba v vsak sev kvasovk pod nadzorom konstitutivnega promotorja pADH vključiti potrebne gene ScERG13, SctHMGR, ScERG12, ScERG8 in ScERG19, spojene s PTS1. V različnih primerih so v zapis vključili sintazo SltNPPS1 iz Solanum lycopersicum, kar omogoča proizvodnjo monoterpenoidnega prekurzorja neril difosfata (NPP), ali heterologna gena GgmFPS144 in AgtGPPS2 iz Gallus gallus oziroma Abies grandis, kar omogoča proizvodnjo NPP, strukturnega izomera geranil difosfata (GPP). V obeh primerih je bil dodan še zapis za PptAPS, ki katalizira reakcijo NPP ali GPP v α-pinen. Povečanje izražanja ScERG13 in SctHMGR je poteklo z uporabo promotorja ScpTEF.

Za primerjavo brezcelične proizvodnje verbenona v in vitro poskusih so pripravili tudi sev kvasovk, ki vsebuje citokrom P450 monooksigenazo (CYP) limonen-3-hidroksilazo (L3H) za sintezo verbenona iz α-pinena.

Končna ocena spremenjenih sevov kvasovk je bila izvedena s kvantifikacijo z uporabo GC-MS analize, ki je potrdila prisotnost α-pinena v obeh variantah kvasovk.

Proizvodnja v citosolu Yarrowia lipolytica

Yarrowia lipolytica je obetaven organizem za sintezo monoterpenoidov, saj vsebuje visoko koncentracijo acetil-CoA, je sposoben učinkovito kopičiti lipide in kaže visoko toleranco do monoterpenoidov. Za izražanje terpinoidnih prekurzorjev v Yarrowia lipolytica so izrazili gena SctHMGR in ScERG13 organizma Saccharomyces cerevisiae. Uvedba genov AgtGPPS2 in GgMFPS144 bi pomenili zmanjšano količino proizvedenega farnezil pirofosfata (FPP) in povečano količino geranil pirofosfata (GPP). Drugi poskus je predvideval zmanjšanje količine proizvedenega FPP. To so poskušali narediti z uvedbo SltNPPS1 za proizvodnjo neril pirofosfata (NPP). Dodan je bil še gen PptAPS za proizvodnjo α-pinena.

cPCR nikoli ni pokazal uspešne vstavitve genov, temveč so opazili le dolžine, ki bi jih pričakovali od prvotnega genomskega zaporedja. Zaradi časovnih omejitev pa poskus ni nadaljeval.

Proizvodnja v citosolu Yarrowia lipolytica

Y. lipolytica je zaradi njegovega obsežnega metabolizma maščobnih kislin zanimiv organizem za peroksisomsko proizvodnjo monoterpenoidov. Poskus je predvideval implementacijo presnovnih poti, ki uporabljajo GPP ali NPP kot substrat za monoterpensko sintazo PptAPS v peroksisomih Y. lipolytica. Geni, ki naj bi bili močno izraženi, so bili pod regulacijo promotorja YlpTEF, medtem ko so bili geni, ki so zahtevali šibkejšo ekspresijo, sestavljeni s promotorjem YlpGAP.

Vsi geni poti, ki uporabljajo NPP, so bili uspešno sestavljeni, vendar zaradi pomanjkanja časa projekt ni nadaljeval.

LITERATURA

[1] A. El Asbahani, K. Miladi, W. Badri, M. Sala, E. H. A. Addi, H. Casabianca, A. El Mousadik, D. Hartmann, A. Jilale, F. N. R. Renaud, et al.: Essential oils: From extraction to encapsulation. International Journal of Pharmaceutics. Elsevier B.V. April 15, 2015, pp 220–243.
[2] Q. Gao, L. Wang, M. Zhang, Y. Wei, W. Lin: Recent Advances on Feasible Strategies for Monoterpenoid Production in Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. Frontiers Media S.A. December 1, 2020.
[3] O. A. Carter, R. J. Peters, R. Croteau: Monoterpene biosynthesis pathway construction in Escherichia coli. Phytochemistry 2003, 64, 425–433.
[4] M. T. Lundemo, J. M. Woodley: Guidelines for development and implementation of biocatalytic P450 processes. Applied Microbiology and Biotechnology. Springer Verlag February 28, 2015, pp 2465–2483.
[5] C. Ignea, M. H. Raadam, M. S. Motawia, A. M. Makris, C. E. Vickers, S. C. Kampranis: Orthogonal monoterpenoid biosynthesis in yeast constructed on an isomeric substrate. Nat. Commun. 2019, 10.
[6] J. Zhao, X. Bao, C. Li, Y. Shen, J. Hou: Improving monoterpene geraniol production through geranyl diphosphate synthesis regulation in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 100, 4561–4571.
[7] S. Dusséaux, W. T. Wajn, Y. Liu, C. Ignea, S. C. Kampranis: Transforming yeast peroxisomes into microfactories for the efficient production of high-value isoprenoids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2020, 117, 31789–31799.
[8] C. Brocard, A. Hartig: Peroxisome targeting signal 1: Is it really a simple tripeptide? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. Biochim Biophys Acta December 2006, pp 1565–1573.
[9] S. Zernia, F. Ott, K. Bellmann-Sickert, R. Frank, M. Klenner, H. G. Jahnke, A. Prager, B. Abel, A. Robitzki, A. G. Beck-Sickinger: Peptide-Mediated Specific Immobilization of Catalytically Active Cytochrome P450 BM3 Variant. Bioconjug. Chem. 2016, 27, 1090–1097.
[10] J. N. Bröker, B. Müller, N. van Deenen, D. Prüfer, C. Schulze Gronover: Upregulating the mevalonate pathway and repressing sterol synthesis in Saccharomyces cerevisiae enhances the production of triterpenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2018, 102, 6923–6934.
[11] S. Brown, M. Clastre, V. Courdavault, S. E. O’Connor: De novo production of the plant-derived alkaloid strictosidine in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2015, 112, 3205–3210.
[12] C. Y. Zhang, N. B. Lin, X. S. Chai, Zhong-Li, D. G. Barnes: A rapid method for simultaneously determining ethanol and methanol content in wines by full evaporation headspace gas chromatography. Food Chem. 2015, 183, 169–172.