Biogeneza ribosomov pri arhejah

Uvod

Ribosomi so univerzalni ribonukleoproteinski kompleksi, ključni za prevajanje genetske informacije iz mRNA v proteine in posledično za zagotavljanje pravilne ekspresije genov. Pod njihovo biogenezo štejemo vse procese, od katerih je odvisen njihov nastanek in čeprav so prisotni v vseh živih celicah, kažejo visoko variabilnost znotraj treh domen.

Strukturne komponente ribosoma

Strukturno ribosome arhej razdelimo na dve podenoti, ki interagirata z ribosomskimi r-proteini. Enako kot pri bakterijah, je velika podenota 50S iz 23S ter 5S rRNA, majhna 30S pa iz 16S rRNA. Kljub temu, da prokariontske celice jedra nimajo, opazimo podobne strukturne značilnosti med evkarionti in prokarionti. Večino evkariontske rRNA je karakterizirana z dodatkom ekspanzijskih segmentov, ES. Njihova funkcija ostaja neznana, kažejo pa lastnosti povečanja velikosti in kompleksnosti rRNA, namreč so razlog, da je evkariontski ribosom toliko večji v primerjavi z prokariontskim. Po zadnjih raziskavah so bili najdeni tudi v bakterijah in arhejah, čeprav omejeni v velikosti in številu, a kljub temu niso določili evolucijske podobnosti glede na sekvenco in strukturno homologijo.

Ribosomske proteine arhej lahko razdelimo v tri skupine: univerzalno konzervativni r-proteini; r-proteini deljeni izključno med evkarionti in arhejami in le za arheje specifični r-proteini. Med 70 različnimi r-proteini v arhejah, jih samo 54 najdemo v vseh, 33 od tega jih je univerzalno ohranjenih. Strukturna variabilnost r-proteinov korelira z generalnim znižanjem kompleksnosti strukture v skupini arhej, saj so bili r-proteini prednikov kompleksnejši. Kakšne so posledice takšne evolucije r-proteinov za biogenezo ribosomov ostaja nejasno. Prav tako ne smemo izključiti insercij, delecij in variacij v sekvenci ohranjenih r-proteinov, ki so nekaj običajnega. Posebnost organizacije r-proteinov v nekaterih ribosomskih podenotah je to, da pripomorejo k stehiometriji obeh podenot, ta lastnost pa kontrastira z opazovanimi bakterijskimi in evkariontskimi sistemi, kjer so r-proteini izključno strukturne komponente.

Organizacija, sinteza in procesiranje rRNA

Nastanek ribosoma je energijsko potraten in kompleksen proces. Organizacija rRNA genov kaže razlike med različnimi skupinami arhej. Za primer lahko pogledamo rod Euryarchaeota, kjer se vsi geni prepišejo naenkrat. Nasprotno, so pri Proteoarchaeota 5S rRNA geni fizično ločeni od večjih dveh rRNA genov in prepisani ločeno. V nekaterih primerih so lahko kar vsi trije geni nepovezani in prepisani posebaj. Med večino 16s in 23s – 5s rRNA najdemo ITS (internal transcribed spacer, spacer DNA) oziroma intergensko regijo, ki je nekodirajoča DNA med geni. ITS se lahko pojavi v več kopijah in v večini primerov vsebuje Ala-tRNA gen, pri nekaterih arhejah pa ima še sekundarni Cys-tRNA gen, ki se nahaja na 3' koncu 5S gena. Primarni rRNA transkripti (pre-rRNA) arhej dozorijo drugače, kot pa tisti v bakterijah in evkariontih, čeprav opazimo značilnosti obeh skupin. Pri bakterijah se zaporedja, ki se raztezajo čez rRNA gene, paroma povežejo do tvorbe dvojne vijačnega debla, ki je tarča določenih endonukleaz za izrezovanje intronov oziroma pričetek zorenja rRNA. Pri bakterijah te reže RNAza III, v arhejah pa najdemo BHB (bulge-helix-bulge) motive, ki so lahko prepoznani z za arheje specifično »splicing« RNA endonukleazo. V posameznih primerih kaže procesiranje 16S rRNA značilnosti, ki so homologne evkariontskim procesom, še posebaj endonukleaze, ki režejo enkrat ali dvakrat na 5' koncu. Pomembno je tudi najbolj oddaljeno za procesiranje, mesto 0, ki leži pred 16S 5' koncem in ima podobnosti procesiranja z mestom A0 v evkariontih, ki je eden najzgodnejših odsekov, kjer se procesiranje prične. Pri arhejah je rezanje na mestu 0 neodvisno od nastanka debla in prepoznavnih BHB motivov, ampak je usmerjeno s specifično sekvenco, ki vsebuje CUU motiv, najdenega tudi v evkariontih. Rezanje na mestu 0 pri evkariontih sicer zahteva ribonukleoproteinski delec, ki vsebuje snoRNA (small nucleorlar RNA), kar v arhejah ne opazimo. Čeprav naj homologi evkariontske snoRNA nebi sodelovali v procesiranju rRNA v arhejah, sodelujejo v drugih procesih, na primer pri kemijskih modifikacijah rRNA.

Modifikacije ribosomalne RNA

Modifikacije ribosomalne RNA so bile najdene v vseh dosedanjih raziskavah, vendar se med arhejami razlikujejo. Razdelimo jih v dve večji skupini: modifikacije riboze in modifikacije baz. Prav tako jih lahko razdelimo glede na mehanizem poteka na dve podskupini: modifikacije s samostojni encimi, ki jih najdemo v vseh domenah in RNA-vodene modifikacije, ki uporabijo ribonukleoproteinske (RNP) komplekse, da vodijo in modificirajo tarčno rRNA. Ti so prisotni pri arhejah in evkariontih, pri bakterijah pa ne in sodelujejo pri obeh vrstah modifikacij. Prva, modifikacija riboze, kjer pride do 2'O-metilacije riboze z C/D box sRNPji in druga, modifikacija baze z izomerizacijo uridina v psevdouridin z H/ACA box sRNPji. Pri evkariontih nekateri snoRNP nimajo poznane funkcije modificiranja rRNA, ampak sodelujejo pri procesiranju pre-rRNA, kot že omenjeno zgoraj. V arhejah pa takšni snoRNPji, ki bi imeli samo to funkcijo brez zmožnosti modificiranja, niso znani. Zraven teh dveh glavnih vrst modifikacij poznamo tudi druge modifikacije baz, kot so metilacije in acetilacije ali katere večje modifikacije na rRNA. Te modifikacije so večinoma zbrane v funkcionalnih centrih ribosomalnih podenot in imajo funkcijo stabilizacije in/ali podpore pri translacijskem mehanizmu. Obseg modifikacij se med arhejami zelo razlikuje. Halofilne arheje imajo nizko število modifikacij kar je povezano z zmanjšanim številom r-proteinov in ribosomskih biogeneznih faktorjev v teh organizmih. V termofilnih in hipertermofilnih arhejah pa je število teh modifikacij povečano - na primer organizmi iz rodu Thermococcales, ki uspevajo pri zelo visokih temperaturah, imajo povečano število baznih acetilacij, katere povzročijo homologi evkariontskih RNA citidin acetiltransferaz Kre33/Nat10. Te modifikacije so za razliko od drugih porazdeljene po celotni sekvenci rRNA. Skoraj edini univerzalno ohranjen faktor pri biogenezi ribosomov je dimetiltransferaza KsgA/Dim1 majhne podenote, ki metilira dva univerzalno ohranjena adenozina na 3' koncu rRNA. Te ugotovitve nas pripeljejo do spoznanja, da je relativno število rRNA modifikacij in njihova diverziteta povezana s specifično adaptacijo organizma na okolje in z njegovo evolucijsko tirnico. Funkcionalna vloga variabilnosti rRNA modifikacij pri biogenezi ribosomov pri arhejah in kako ti mehanizmi modifikacij pripomorejo k nastanku ribosomov pa še ni znano.

In vitro študije

In vitro eksperimenti so pokazali, da kljub velikosti makromolekulskega kompleksa kot je ribosom, ta vsebuje vse komponente potrebne za nastanek funkcionalnega delca. Proces nastajanja ribosoma se začne z vezavo določenih »zgodnjih« r-proteinov na specifična mesta rRNA do tvorbe intermediata, ki nato veže manjkajoče r-proteine. Kasneje pride do določenih strukturnih konformacij in nastanka ribosomskih podenot, ki se nato lahko združita v funkcionalen ribosom. Pogoji, pri katerih jim je uspela sestava funkcionalnega kompleksa, so neprimerljivi s tistimi v celicah, zato raziskovalci sklepajo na prisotnost drugih mehanizmov, ki pomagajo pri sestavi ribosoma. Enega izmed teh je prvič priporočal nemški biokemik Knud Nierhaus. To je mehanizem kotranskripcije in direktna spojitev r-proteinov (iz smeri 5’ proti 3’), ki olajša prvi del nastajanja ribosoma. Takšno 5’-3’ koordinacijo začetne pre-rRNA najdemo v arheji H. volcanii. Poleg teh lahko v organizmih najdemo tudi dodatne ribosomske biogenetske faktorje, ki olajšajo ali pospešijo nastajanje kompleksa. In vitro študije so tako pokazale, da je nastanek ribosoma koordiniran proces, ki vsebuje številne specifične korake. Saccharolobus solfataricus (Sulfolobus) je termofilna arheja, ki živi v temperaturnem območju med 80 in 85 °C. Za termofile je značilno, da imajo njihovi ribosomi večje število r-proteinov kot organizmi, ki živijo pri sobnih temperaturah. Znanstveniki so odkrili, da pri teji arheji nastajanje ribosoma sestavljata dva ključna koraka: prvi se zgodi že pri temperaturah okoli 60 °C, drugi pa le nad 80 °C, zato sklepajo, da je nujna visoka temperatura za strukturne konformacije proteinov, ki bi omogočile rRNA-protein interakcije. To nam le potrdi, da se sestava celotnega ribosoma zgodi pri točno določenih pogojih. Pri Haloferax mediterranei, ki je halobakterija, so se podenote 30S in 50S sestavile samo pri visokih koncentracijah soli oziroma enakih, kot je v celici. K+ in NH4+ soli sta se izkazale za najbolj učinkovite pri omogočanju sestave ribosoma. Za razliko z bakterijami, S. solfataricus in E. Coli, se ribosom H. mediterranei sestavi v enem koraku pri 42 °C, kar je za to arhejo optimalna temperatura, saj je mezofilni organizem. Ob ugotavljanju pogojev, ki omogočijo sestavljanje ribosoma so lahko identificirali še začetno povezovalne r-proteine, ki so nujni, da se komponente posameznih podenot lahko začnejo združevat do sestave kompleksa. Nastanek intermediata kompleksa omogočijo že pri nižjih, celotna podenota pa se sestavi le pri optimalnih temperaturah. Zanimivo je tudi, da se kompleks lahko sestavi, če so r-proteini in rRNA iz različnih organizmov in so med seboj kompatibilni. Na primer to se lahko zgodi med različnimi vrstami bakterij, saj se je izkazalo, da so nekateri pomembni r-proteini v domeni prokariontov med vsemi vrstami močno ohranjeni. V enem eksperimentu so inkubirali proteine velike podenote iz S. solfataricus z 23S rRNA iz H. mediteraneii ali E. coli, rezultat pa je bil ta, da je nastal 40S ribosom. Če pa so te iste r-proteine inkubirali z rRNA kvasovke Saccaromyces cerevisiae, kompleks ni nastal. Iz tega vidimo, da sta osnovna arhitektura ribosomov in struktura rRNA podobni med domenama bakterij in arhej, pri evkariontih pa je biogeneza ribosomov kompleksnejša in se zato razlikuje od prvih dveh.

Faktorji biogeneze ribosomov

Biogeneza ribosomov potrebuje za svoj potek sodelovanje dodatnih biogeneznih faktorjev, ki so pri bakterijah in evkariontih že dobro raziskani. Običajno začasno reagirajo z nastajajočo podenoto ribosoma in izvedejo proces biogeneze ribosomov. Med temi faktorji najdemo veliko število tistih, ki imajo encimsko aktivnost, predvsem NTPazno aktivnost, kar predvidevajo, da pripomore pri energijsko odvisnih korakih pri izgradnji ribosomov. GTP odvisne procese najdemo predvsem v bakterijah, medtem ko so ATP odvisni procesi dosti bolj pogosti pri evkariontih. Za razliko od dobro univerzalno ohranjenih ribosomskih podenot, je večina ribosomskih biogeneznih faktorjev neohranjenih skozi evolucijo, njihova količina pa je v evkariontih povečana. To nam pove, da se je biogenezna pot ribosomov med evolucijo večkrat spremenila, še vedno pa obstajajo podobnosti in analogije med različnimi potmi izgradnje. Obstoj homologov sekvenc ribosomalnih biogeneznih faktorjev med arhejami in evkarionti nam potrdi možnost o skupnem izvoru poti biogeneze ribosomov pri obeh domenah. Ti homologi so aktivni pri zadnjih korakih evkariontskega zorenja velike in male podenote. Čeprav ni prišlo do velike ohranjenosti sekvence in strukture faktorjev med bakterijami in evkarionti, so tisti, ki so vključeni v kasnejše korake zorenja majhne podenote združeni v analogno strukturno regijo, to so regije, ki kasneje tvorijo funkcionalne centre. Homologi faktorjev niso enakomerno porazdeljeni po celotnem genomu arhej, ampak sledijo redukcijskemu evolucijskemu trendu, ki ga opazimo pri r-proteinih, kar prikazuje poenostavljeno pot izgradnje ribosomov pri takšnih organizmih. Prav tako ne moremo izključiti možnosti obstoja specifičnih r proteinov ali faktorjev za arheje, ki po drugi strani povečajo kompleksnost samega procesa. Do sedaj je analiza arhejskih ribosomskih biogeneznih faktorjev še zelo omejena, saj jih je bilo le nekaj določenih in vivo, ti pa so homologi evkariontskim. Odkrili so prisotnost dimetiltransferaze KsgA/Dim1in člane družine Rio ATPaz/kinaz, ki igrajo pomembno vlogo pri zadnjih korakih zorenja majhne podenote pri evkariontih in imajo pri arhejah verjetno podobno funkcijo. S primerjavo lahko ugotovimo, da so zadnji koraki biogeneze majhne podenote pri arhejah le poenostavljeni zadnji koraki biogeneze pri evkariontih, vendar stopnja funkcijske ohranjenosti homologov Rio1, Fap7, Dim1, Pno1 in Nob1, ki so vsi ključni faktorji pri evkariontih, mora biti pri arhejah še dodatno raziskana.

Zaključek

Razumevanje biogeneze ribosomov pri arhejah nam otežuje že sama razlika v mehanizmih od vrste do vrste arhej. Zanima nas predvsem funkcionalna adaptacija in diverziteta biogeneze skozi evolucijo, za polno sliko samega procesa pa bodo seveda ključne nove raziskave na tem področju.

Viri

1. Londei P and Ferreira-Cerca S (2021) Ribosome Biogenesis in Archaea. Front. Microbiol. https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.686977

2. Michael Jüttner , Sébastien Ferreira-Cerca, Looking through the Lens of the Ribosome Biogenesis Evolutionary History: Possible Implications for Archaeal Phylogeny and Eukaryogenesis, Molecular Biology and Evolution, Volume 39, Issue 4, April 2022, msac054. https://doi.org/10.1093/molbev/msac054

3. Kaczanowska M, Rydén-Aulin M. Ribosome biogenesis and the translation process in Escherichia coli. Microbiol Mol Biol Rev. 2007 Sep;71(3):477-94. https://doi.org/10.1128/MMBR.00013-07

4. Jiao, L., Liu, Y., Yu, XY. et al. Ribosome biogenesis in disease: new players and therapeutic targets. Sig Transduct Target Ther 8, 15 (2023). https://doi.org/10.1038/s41392-022-01285-4