ReMixHD

ReMixHD je projekt, s katerim je ekipa z Univerze v Heidelbergu sodelovala na tekmovanju iGEM 2023.

Problem

Na svetu se vsako leto proizvede 430 milijonov ton plastike, kar vodi do nastanka velike količine plastičnih odpadkov. Le majhen delež odpadkov se reciklira, saj s trenutnimi tehnikami lahko recikliramo le tiste plastične produkte, ki so sestavljeni samo iz ene vrste polimera. Za postopek reciklaže je potrebne veliko energije, pri tem nastajajo toplogredni plini, prav tako pa je potrebno zagotoviti ustrezno infrastrukturo. Na drugi strani je prisotnih veliko odpadkov iz mešane plastike (plastika, ki jo sestavlja več različnih polimerov), ki se kopičijo na smetiščih ali pa jih sežgejo v sežigalnicah, ker ne obstaja metoda, s katero bi lahko tako plastiko ustrezno reciklirali [1].

Rešitev

Plastiko bi lahko reciklirali na trajnosten način z uporabo genetsko spremenjene bakterije Pseudomonas fluorescens. Ustvarili bi kokulturo, ki bi jo sestavljala dva seva P. fluorescens. Pomožni sev bi razgrajeval (depolimeriziral) polietilen tereftalat (PET) in polietilen (PE), nastali intermediati pa bi služili kot vir ogljika za glavni sev, ki bi sintetiziral rekombinantne produkte. Seva bi lahko prilagodili glede na lokalne potrebe. Tako bi lahko pomožni sev razgrajeval katerikoli polimer, vključen v plastiko, glavni sev pa bi lahko sintetiziral vse od industrijskih komponent, antibiotikov do krme za živali. Za čim višji izkoristek kokulture so želeli razviti operon, ki kontrolira rast pomožnega seva glede na količino plastike in koncentracijo intermediatov [1].

Uporabljene komponente

Pseudomonas fluorescens

Bakterije iz rodu Pseudomonas imajo naravno sposobnost razgradnje plastike (lahko metabolizirajo nekatere polimere, npr. polietilen, polipropilen, polisitren …). Nekateri predstavniki tega rodu so patogeni in kot taki niso primerni za uporabo za namene bioremediacije. P. fluorescens pa je nepoatogena, polega tega pa lahko kot končni akceptor elektronov uporablja dušik. To predstavlja prednost pri gojenju v večjih količinah, kjer kisik hitro postane omejujoč faktor rasti [1].

XylS

Razgradnjo PET nadzorujemo preko transkripcijskega faktorja XylS. Z uvedbo mutacij dobimo obliko XylS-mt, ki je bolj občutljiva na prisotnost tereftalne kisline (TPA). XylS se aktivira ob vezavi TPA ali induktorja 3-metilbenzoata (MBA), kar vodi v dimerizacijo XylS. Dimer se veže na promotor Pm in ga aktivira, s tem pa se sproži transkripcija male regulatorne RNA (sRNA). sRNA blokira translacijo želenega gena (GOI – gene of interest). S tem se vzpostavi negativna povratna zanka, ki zavira sintezo GOI, kadar razgradnja PET poteka hitro. Sintezo transkripcijskega faktorja XylS-mt regulira promotor Ps1/Ps2. Izražanje s promotorja Ps2 je konstitutivno, kar zagotavlja bazalno raven XylS-mt v odsotnosti TPA. Po dimerizaciji XylS-mt s TPA pa se dimer veže na promotor Ps1, kar privede do povečane sinteze tega transkripcijskega faktorja [1, 2].

sRNA

V organizmih je pogosto prisotna represija genov z majhno RNA (sRNA). sRNA ima dve regiji. Ena je homologna mRNA in omogoča nastanek dupleksa mRNA – sRNA, druga pa omogoča vezavo proteina hfq, ki razgradi mRNA [1, 3].

AlkS

Sistem AlkS/pAlkB tvori pozitivno povratno zanko, ki vpliva na izražanje GOI glede na količino n-alkanov. Pri razgradnji ogljikovega ogrodja PE nastanejo n-alkani. Njihova dolžina ni znana, verjetno pa nastanejo fragmenti, krajši od 17 C-atomov. Dolgoverižni alkani namreč ne morejo prehajati membrane z difuzijo, v membrani Pseudomonas fluorescens pa niso našli transporterjev za alkane, daljše od 16 C-atomov. n-alkan se veže na transkripcijski faktor AlkS, ga aktivira, ta kompleks pa aktivira promotor pAlkB in sintezo GOI [1, 4].

Encimi za razgradnjo PET in PE

Pri PET se izmenjujeta molekuli tereftalne kisline in etilen glikola, ki sta med seboj povezani z estrsko vezjo. V naravi so odkrili dve esterazi, ki bi lahko cepili vez v PET: WT-PETaza in LCC (leaf-branch compost cutinase). Težava pri teh encimih so pogoji delovanja, saj največjo aktivnost dosegajo pri temperaturah nad 50 °C in pri alkalnih pH-vrednosti, medtem ko so optimalni pogoji za rast P. fluorescens 28 °C in nevtralni pH. Aktivnost teh encimov v bakteriji je zato znatno nižja, suboptimalno pa delujeta tudi izboljšani različici encima FAST-PETaza in LCC [1, 5]. PE ima ogrodje sestavljeno iz samih ogljikovih atomov, kar otežuje encimsko razgradnjo, saj ni prisotne nobene skupine, kjer bi lahko potekla hidroliza. Natančen mehanizem razgradnje še ni znan, pri tem pa sodeluje alkan monooksigenaza AlkB, ki so jo našli v več različnih vrstah bakterij iz rodu Pseudomonas. AlkB oksidira srednje dolge n-alkane v ustrezne alkohole v perplazmi. Nastali alkoholi potujejo skozi membrano v citoplazmo, kjer se oksidirajo v maščobne kisline in vstopijo v cikel β-oksidacije [1]. Da pride do razgradnje plastike, se mora encim izločati iz celice, kar lahko dosežemo tako, da proteinu dodamo oznako za eksport (export tag). Ti označevalci omogočajo uporabo transportnega sistema za želatinazo ali maltotetroza-formin amilazo [1].

mKate2

Pri testiranju ekspresijskih sistemov so GOI zamenjali s fluorescenčnim reporterskim proteinom. Pri izboru proteina so morali upoštevati dejstvo, da ima P. fluorescens lastno fluorescenco, zato so morali izbrati reporter z valovnimi dolžinami vzbujanja in emitiranja, ki so drugačne od bakteriji lastne fluorescence. Ker so želeli spremljati dinamiko operona, je bil drug pomemben kriterij za izbor hitrost dozorevanja proteina. mKate2 izpolnjuje oba kriterija, zato so za testiranje uporabili ta fluorescenčni reporter [1].

Glavni sev

Naloga glavnega seva je uporaba TPA kot vira ogljika za sintezo rekombinantnega produkta. Gene, ki so potrebni za vnos TPA v celice, so v P. fluorescens vnesli s plazmidom pBAMD1-2, ki je vseboval operon tphII in transporter za vnos TPA v celico. Za pretvorbo TPA v protokatehinsko kislino (PCA) so potrebni 4 geni. PCA lahko vstopi v metabolizem ogljika po β-ketoadipatni poti. Zaradi narave operona že sama TPA predstavlja selekcijski pritisk in zato za selekcijo ni potrebno uvajati rezistence na antibiotike [1].

Rezultati

Senzor za zaznavanje razgradnje PE

Senzor za zaznavanje alkanov sestavljata transkripcijski faktor AlkS in promotor pAlkB. Izražanje transkripcijskega faktorja AlkS je pod nadzorom konstitutivnega promotorja pEM7, med promotor pAlkB in zapis za AlkS so vstavili gen za reporterski protein mKate2. Preden so senzor okarakterizirali, so optimizirali topnost in biodostopnost alkanov različnih dolžin. Najboljšo topnost so dosegli, če so alkane najprej raztopili v enoodstotni raztopini Tween80 v absolutnem alkoholu, potem pa nastalo raztopino 100-krat redčili z vodo. Testirali so odziv na različne alkane, spremembo pri fluorescenci pa so opazili samo pri n-dodekanu [1].

Senzor za zaznavanje razgradnje PET

Pri testiranju sistema XylS-mt/Pm so za promotor Pm vstavili zapis za mKate2, transkripcijski faktor XylS-mt pa so najprej izražali z naravnim promotorjem Ps1/Ps2. Opazili so nizko fluorescenco, zato so zamenjali promotor s pEM7. Za indukcijo so uporabljali dva induktorja, MBA in TPA. Pri MBA so indukcijo dosegli pri nižji koncentracijah kot pri TPA, pri visokih koncentracijah MBA pa je prišlo do nasičenja. Da po indukciji opazimo znatno razliko v fluorescenci, mora biti prisotna TPA v koncentraciji vsaj 1 mM [1].

Represija s sRNA

Konstruirali so 27 različnih sRNA, ki so se razlikovale v ogrodni in homologni regiji, s katerimi so ciljali konstitutivno izražen mKate2. Zaporedja za sRNA so vstavili za promotor Pm. Moč represije so izračunali na podlagi znižane fluorescence. Najmočnejša represija je bila prisotna pri konstruktih, ki so na tarčni mRNA ciljale vezavno mesto za ribosom (RBS) [1].

Sestava končnega operona

Osnova za sestavljanje je bil plazmid pSEVA438 z XylS-mt. Vektor so liearizirali s PCR tako, da so dodali previsne homologne konce za pAlkB in AlkS. Sintetizirali so novo zaporedje, ki je vsebovala RBS 2 (BBa_J61101), prepoznavno mesto za restriktazo BsaI in terminator LUZ7T50. Fragmente so povezali z metodo po Gibsonu. Z metodo Golden Gate so preko restrikcijskega mesta BsaI vstavili zapis za mKate za RBS 2. S sekvenciranjem so potrdili zaporedje vektorja in vključka, vendar jim s končnim konstruktom ni uspelo transformirati ne P. fluorescens ne E. coli [1].

Encimi

Sintetizirali so kodirajoča zaporedja za WT-PETazo, FAST-PETazo, LCC in AlkB, jih vstavili v pSEVA438, izrazili v P. fluorescens, jih izolirali in testirali njihovo aktivnost. AlkB je membranski protein, ki potrebuje posebne membranske kofaktorje, zato izolacija tega encima ni bila uspešna in posledično niso mogli testirati njegove funkcionalnosti. Pri ostalih encimih so lahko izračunali parametre Michaelis-Mentenine kinetike. Največjo encimsko aktivnost je imela FAST-PETaza, ki je imela v primerjavi z WT-PETazo in LCC 4-krat višjo maksimalno hitrost (vmax) [1].

Model

Z bioinformatskimi metodami so razvili tudi digitalnega dvojčka, da lahko predvidimo obnašanje kokulture. Želeli so ustvariti model, s katerim bi lahko predvideli evolucijo in spreminjanje kokulture s časom, hitrost razgradnje plastike, učinke izbijanja in dodajanja genov ter hitrost rasti. Ti podatki so pomembni predvsem pri povečanju obsega gojenja mikroorganizmov, ko poskušamo stvar z laboratorijskih količin prenesti na industrijsko raven. Razvoj modela je potekal sočasno z eksperimenti v laboratoriju. Razvili so metabolični model na genomski skali, ki uporablja genomsko informacijo za identifikacijo metaboličnih poti. Dodali so tudi dinamični analizo ravnotežja pretokov (dFBA – dynamic flux-balance analysis) in simulacijo kokultre (cFBA – co-culture simulation) [1].

Viri

1. ReMixHD https://2023.igem.wiki/heidelberg/ (pridobljeno 11. apr. 2023).
2. A. Gawin, S. Valla, T. Brautaset: The XylS/ Pm regulator/promoter system and its use in fundamental studies of bacterial gene expression, recombinant protein production and metabolic engineering. Microb. Biotechnol. 2017, 10, 702–718.
3. G. Storz, J. Vogel, K. M. Wassarman: Regulation by Small RNAs in Bacteria: Expanding Frontiers. Mol. Cell 2011, 43, 880–891.
4. D. Chen, S. Xu, S. Li, S. Tao, L. Li, S. Chen, L. Wu: Directly Evolved AlkS-Based Biosensor Platform for Monitoring and High-Throughput Screening of Alkane Production. ACS Synth. Biol. 2023, 12, 832–841.
5. H. Lu, D. J. Diaz, N. J. Czarnecki, C. Zhu, W. Kim, R. Shroff, D. J. Acosta, B. R. Alexander, H. O. Cole, Y. Zhang, idr.: Machine learning-aided engineering of hydrolases for PET depolymerization. Nature 2022, 604, 662–667.