PET-2-Protein

S projektom "Pet-2-Protein" je skupina Aalto-Helsinki iz Finske leta 2023 sodelovala na tekmovanju iGEM in prejela zlato medaljo.

Avtorica povzetka: Zala Perko

Uvod

Dva izmed poglavitnih izzivov, s katerimi se danes soočamo v svetu, sta onesnaževanje okolja s plastičnimi odpadki in pomanjkanje hrane.

Kljub ekološkim in zdravstvenim posledicam na svetu vsako leto proizvedemo kar 400 milijonov ton plastike, od katerih več kot polovica konča na odlagališčih in v naravi. Postala je del ekosistemov, v katerih so se pojavili mikroorganizmi, ki lahko plastiko izkoristijo kot podlago za pritrjanje, tvorbo biofilmov in izražajo encime za njeno razgradnjo. Z odkritjem PETaze iz bakterije Ideonella sakaiensis, ki lahko polietilen tereftalat (PET) z encimoma PETazo in MHETazo razgradi do tereftalne kisline (TPA) in etilen glikola (EG), se je začelo razvijati novo področje encimske razgradnje plastike, ki je zaradi nižje porabe energije in kemikalij okolju prijaznejša, končni produkti pa so monomerne enote, ki se lahko ponovno uporabijo za sintezo visokokakovostnih produktov [1]–[3].

Več kot 820 milijonov ljudi na svetu je podhranjenih. Število bo še naraščalo, če ne bomo do leta 2050 povečali proizvodnjo hrane za kar 70 %. Zaradi pomena zadostnega vnosa beljakovin v prehrani in podnebnega vpliva živinorejske industrije, ki pridela skoraj 60 % vseh toplogrednih plinov, je ključno iskanje novih okoljsko in ekonomsko sprejemljivih virov beljakovin. Te lahko pridobimo iz mikroorganizmov, ki za rast uporabljajo različne substrate, kot so CO2, metan, odpadni materiali iz živilske industrije in kmetijstva, ter proizvajajo mikrobne proteine (angl. single-cell proteins, SCP) [1],[4].

Cilji projekta

Cilj projekta PET-2-Protein je bil razviti sistem za encimsko pretvorbo PET iz odpadne plastike v proteinsko biomaso, ki bi se lahko uporabljala kot vir beljakovin v prehrani. Ideja sledi principom krožnega gospodarstva in z uporabo sintezne biologije združuje reševanje problema ravnanja s plastičnimi odpadki s trajnostno in okolju prijazno proizvodnjo visokobeljakovinskih živil. Projekt se v treh delih osredotoča na:

1. optimizacijo sistema za proizvodnjo rekombinantnih encimov za razgrajevanje plastike (PETaza in MHETaza),
2. depolimerizacijo PET do monomernih enot (TPA in EG) ter
3. inženiring mikroorganizmov, ki lahko te produkte asimilirajo in uporabijo v lastnem metabolizmu za proizvodnjo proteinsko bogate biomase [1].

Izražanje PETaze in MHETaze

V prvem delu so načrtovali sistem za učinkovito izražanje encimov, ki depolimerizirajo odpadni PET. Zaradi izboljšane temperaturne in pH stabilnosti ter aktivnosti so izbrali FAST-PETazo. Pri hidrolizi PET nastane intermediat mono(2-hidroksietil)tereftalatom (MHET), ki povzroči produktno inhibicijo PETaze [2], zato so želeli vstaviti tudi zapis za divji tip MHETaze, ki MHET razgradi do TPA. Encimska razgradnja poteka zunaj celice, ker polimer ne more prehajati membrane, zato izločanje izraženih proteinov v gojišče izboljša možnost industrijske aplikacije. Konstrukta FAST-PETaze s signalnim peptidom pelB in MHETaze z lamB in His-tagom na C-koncu so poskušali vstaviti v ekspresijski vektor pRSFDuet-1. Uspešno so pripravili le konstrukt s FAST-PETazo, katero so nato izražali v E. coli NEB T7. Detekcije proteina v gojišču niso potrdili. V prihodnje bi izražanje optimizirali z uporabo E. coli s prepustnejšo zunanjo membrano, sočasnim izražanjem bakteriocina, izražanjem v B. subtillis idr. Aktivnost bi lahko izboljšali s fuzijo PETaze in MHETaze s sistemom SpyCatcher/SpyTag. Za ta del so pripravili konstrukte brez signalnih peptidov in N-končnimi oznakami SpyCatcher za FAST-PETazo in SpyTag za MHET-azo z odstranjeno neurejeno regijo [1].

Depolimerizacija PET

V drugi stopnji bi uporabili različne neobdelane in predobdelane oblike PET in spremljali razgradnjo z dvoencimskim sistemom PETaze in MHETaze do TPA in EG pri različnih pogojih. Produkte bi kvantificirali s HPLC in analizirali morfološke spremembe PET. Ker jim encimov ni uspelo izraziti, so merili izgubo mase predobdelanega PET filma kar v gojišču, v katerem so inkubirali E. coli z vstavljenim zapisom za FAST-PETazo. Po 5 dneh niso detektirali nobene spremembe v masi [1].

Proizvodnja mikrobnih proteinov

Načrtovanje metabolne poti za asimilacijo EG

Za metabolizem EG so izbrali dva gena, fucO, ki zapisuje za promiskuitetno propandiol oksidoreduktazo, ki EG pretvarja do glikolaldehida in aldA, ki zapisuje za aldehid dehidrogenazo, ki ga pretvori do glikolata. Ta konstrukt so želeli vstaviti v E. coli K-12, ki naravno ne razgrajuje EG. Ta po poti pretvorb preko glioksilata, 2-fosfoglicerata in piruvata vstopi v citratni cikel. Zapisa za fucO in aldA so vstavili enega za drugim pod lastnim promotorjem T7 v različni multipli klonirni mesti pRSFDuet-1. Zaradi citotoksičnosti glikolaldehida so morali zagotoviti usklajeno izražanje obeh encimov. To so uravnavali na ravni iniciacije translacije z uvajanjem mutacij na 5'-koncu kodirajočih zaporedij, s katerimi so posredno vplivali na ΔG vezave ribosoma, odvisne od tvorbe sekundarnih struktur mRNA. Razliko v hitrostih translacije so znižali za 10-krat (29400 au za fucO in 10600 au za aldA) [1].

Načrtovanje sintetičnih operonov za asimilacijo TPA

Za načrtovanje konstrukta poti asimilacije TPA so 5 različnih genov povezali v umetni operon z usklajenim izražanjem. V tem primeru bi konstrukt vstavili v P. putida KT2440, ki v naravi ne metabolizira TPA. Operon so sestavljali katalitični geni tphA2IIA3IIBIIA1 operona tph iz Comamonas E6 in zapis za transporter tpaK iz R. jostii RHA1. TPA v naravi deluje kot induktor aktivatorja tphRII [5]. Zapis za ta gen so iz operona odstranili, ker je TPA v gojišču stalno prisotna. Zamenjali so tudi gen za transporter tphCII s transporterjem tpaK iz R. jostii RHA1. TPA se pretvori v 1,2-dihidroksi-3,5-cikloheksadien-1,4-dikarboksilat s kompleksom TPA 1,2-dioksigenaze (tphA1IIA2IIA3II), ta pa z DCD dehidrogenazo (tphBII) do protokatehojske kisline, ki vstopi v metabolizem P. putide. Načrtovali so tri ekspresijske kasete tpaK-tphA2IIA3IIBIIA1II pod tremi različno močnimi konstituitivnimi promotorji, da bi se izognili premajhnemu pretoku metabolitov pri prenizkem izražanju oz. metabolni obremenitvi pri previsokem izražanju katerega od encimov. Izbrali so močan (J23102), srednje močan (J23105) in šibek (J21114) promotor iz Andersonove zbirke. mRNA mora ostati stabilna dokler se ne prevedejo vsi geni operona. Prvi trije nukleotidi v regiji 5’ UTR vplivajo na hitrost razgradnje mRNA, zato so izbrali najstabilnejše zaporedje AGU [6]. Temu sledi restrikcijsko mesto SalI, ki omogoča menjavo promotorja in zaporedje, ki tvori lasnično zanko na ravni transkripta. Za terminator so izbrali T1 iz P. putida KT2440. Pri načrtovanju RBS posameznega gena so upoštevali hitrosti in sklopitev translacije na nivoju celotnega operona. Če je ΔG za vezavo ribosoma pri enem genu pozitivna zaradi sekundarne strukture mRNA, ki se ne more spontano razviti, to lahko kompenzira ribosom, ki je prevedel transkript predhodnega gena. Skozi več ciklov so računalniško optimizirali hitrosti iniciacije translacije in transkripcije na željenih mestih. Celotno kaseto dolgo 5472 bp so vstavili v vektor pSEVA231 z nizkim številom kopij (ori BBR1) s sestavljanjem po Gibsonu. Različice prvega fragmenta so vsebovale tri različne promotorje, vsi pa so imeli 40 bp dolge prekrivajoče konce [1].

Modeliranje hitrosti rasti bakterij in proizvodnje biomase v prisotnosti monomerov PET

Pred izvedbo eksperimentov so z analizo ravnotežja pretoka (angl. flux balance analysis) preverili, kateri mikroorganizmi bi lahko uporabljali TPA in EG kot vir ogljika. Za divji tip so izbrali vrste Comamonas testosteroni in Rhodococcus opacus, ki nosita zapise za gene metabolizma TPA znotraj operona tph in Terrisporobacter glycolicus, ki lahko presnavlja EG. Za metabolno inženirstvo asimilacijskih poti pa so izbrali E. coli K12 in Pseudomonas putida KT2440, ki naravno ne metabolizirata TPA in EG. Z algoritmom gapseq so bioinformatsko predvideli metabolne poti na nivoju bakterijskih genomov. Želeli so doseči konstanten pretok, ki maksimizira funkcijo pretvorbe metabolitov v biomaso. Za analizo so izbrali minimalno gojišče M9 z dodatkom kovin v sledovih in TPA oz. EG. Ugotovili so, da pomanjkanje dušika v gojišču omejuje hitrost rasti, zato so povišali koncentracijo amonijaka. Vse bakterije, razen T. glycolicus bolje rastejo na glukozi in akumulirajo več biomase, pri asimilaciji TPA ali EG pa več ogljika izločijo v obliki CO2. Pri modelih so predpostavili, da je maksimalna hitrost pretoka odvisna le od koncentracije metabolitov v gojišču, ker naj vstop v celico ne bi bil omejujoč dejavnik (TPA skozi transporter, EG z difuzijo), dejanska hitrost rasti bakterij v laboratoriju pa je počasnejša zaradi nižje in variabilne hitrosti privzema metabolitov v celice. T. glycolicus zaradi patogenih lastnosti niso testirali v laboratoriju [1].

Eksperimentalna karakterizacija

V zadnji fazi so monomere TPA in EG dodali v minimalno gojišče M9, spremljali rast bakterij in merili koncentracijo proteinov. Najprej so preverili sposobnost asimilacije TPA pri R. opacus DSM 43205 z mapiranjem genov na katalitične gene tph iz Comamonas E6 in transporterja tpaK iz sorodnega seva R. jostii RHA1. Z uporabo ColabFold so predvideli proteinske strukture in iz nizkih vrednosti RMSD ob primerjavi struktur proteinov tph iz Comamonas E6 sklepali na podobno funkcijo genov. Konstruktov s sintetičnimi operoni niso preverili eksperimentalno. Spremljali so le rast divjih tipov treh vrst bakterij. R. opacus in P. putida sta lahko rasla na minimalnih gojiščih M9 v prisotnosti 30 mM TPA oz. 10 g/L EG, C. testosteroni pa le v prisotnosti 30 mM TPA. Izkoristek biomase pri R. opacus in C. testosteroni so analizirali s HPLC kot upadanje deleža TPA s časom. Samo R. opacus je lahko metaboliziral TPA in proizvajal biomaso, kar so preverjali 5 dni z merjenjem koncentracije proteinov po Bradfordu. V prihodnosti bi preverili tudi vsebnost ostankov plastike in toksičnih produktov v biomasi ter zasnovali sistem za biosintezo specifičnih aminokislin. Dehidrirana biomasa bi se lahko uporabljala kot vir beljakovin v prehrani (npr. kot proteini v prahu), kot živalska krma, v insektnem gojišču pri proizvodnji biopesticidov idr. [1]

Literatura

[1] Aalto-Helsinki - iGEM 2023. Pridobljeno 15. april 2024, s https://2023.igem.wiki/aalto-helsinki/home.

[2] B. Zhu, D. Wang, N. Wei: Enzyme Discovery and Engineering for Sustainable Plastic Recycling. Trends Biotechnol 2022, 40, 22–37.

[3] J. Chow, P. Perez‐Garcia, R. Dierkes, W. R. Streit: Microbial Enzymes Will Offer Limited Solutions to the Global Plastic Pollution Crisis. Microb Biotechnol 2023, 16, 195–217.

[4] A. Ritala, S. T. Häkkinen, M. Toivari, M. G. Wiebe: Single Cell Protein—State-of-the-Art, Industrial Landscape and Patents 2001–2016. Front Microbiol 2017, 8.

[5] D. Kasai, M. Kitajima, M. Fukuda, E. Masai: Transcriptional Regulation of the Terephthalate Catabolism Operon in Comamonas Sp. Strain E6. Appl Environ Microbiol 2010, 76, 6047–6055.

[6] D. P. Cetnar, H. M. Salis: Systematic Quantification of Sequence and Structural Determinants Controlling MRNA Stability in Bacterial Operons. ACS Synth Biol 2021, 10, 318–332.