Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

Uvod

Replikacija po mehanizmu kotalečega kroga predstavlja enega izmed ključnih procesov na področju genetike mikroorganizmov, ki se pojavlja pri bakterijah in virusih. Za bakterije predstavlja enega od načinov samopodvojevanja plazmidov. Plazmidi so krožne samopodvajajoče se molekule DNA, ki sodelujejo pri horizontalnem prenosu genov in bakterijam omogočajo prilagajanje okoljskim razmeram in poselitev novih ekoloških niš z uvajanjem novih genetskih lastnosti. Poleg temeljne biološke vloge, je razumevanje mehanizma kotalečega kroga uporabno v genskem inženiringu za konstrukcijo rekombinantne DNA in proizvodnjo enoverižne DNA ter predstavlja potencialno tarčo za razvoj protimikrobnih sredstev, saj omogoča način nadzora bolezni z zaviranjem replikacije plazmidov v patogenih bakterijah.

Skupne značilnosti RCR plazmidov

RCR plazmidi vsebujejo genetske elemente potrebne za replikacijo, pogosto tudi za odpornost na antibiotike in mobilizacijo. Njihova majhnost in visoko število kopij omogočata učinkovito širjenje med vrstami mikrobov. Skupen jim je replikacijski mehanizem, okvirno število nastalih kopij (med 20 in 30 kopij - odvisno od gostitelja) in povprečna velikost, običajno do 10 kbp. Vsebujejo module za različne funkcije: LIC modul za replikacijo vodilne verige, mesto sso (single-strand origin) za začetek sinteze dvoverižne DNA na enoverižni zastajajoči verigi, DET za odpornost na antibiotike in pri avtonomnih plazmidih še MOB modul, ki omogoča mobilizacijo plazmida. Najmanjši izmed RCR plazmidov kodirajo le Rep protein in komponentne nujne za kontroliranje števila nastalih kopij. RCR plazmidi se med bakterijami tako prenašajo s transdukcijo, tansformacijo ali konjugacijo, kar jim omogoča učinkovit prenos Abr značilnosti (Antibiotic Resistance Traits) in uspešno prilagajanje okoljskim razmeram.Vsebujejo do dva mob gena (kodiranjo gene za mobilizacijske proteine, vključene v mobilizacijo RCR plazmidov med konjugacijo). Vsebujejo tudi mesto oriT (origin of transfer), kamor se vežejo relaksaze pri iniciaciji konjugacije. [10.1007/978-3-319-75241-9_4] Plazmidi RCR se pogosto kointegrirajo (združijo) z drugimi RCR plazmidi ali večjimi plazmidi, ki se podvajajo po mehanizmu theta, zaardi česar so učinkoviti vektorji pri širjenju odpornosti na antibiotike med populacijami bakterij. Prisotni so predvsem pri Gram-pozitivnih bakterijah, pojavjajo pa se tudi v Gram-negativnih bakterijah, arhejah in rastlinskih mitohondrijih. Odkriti so bili pri E. coli bakteriofagu f X174 in kmalu tudi v drugih fagih (M13, f1, in fd) in stafilokokih, čeprav je pri teh prihajalo do določenih razlik v vezavi med Rep proteini in tarčno DNA.

Družine RCR plazmidov

Opisan mehanizem so odkrili pri stafilokoknih plazmidih pC194 in pT181. RCR plazmidi so razvrščeni v več družin na podlagi zaporedja in delovanja njihovih Rep in Mob proteinov (vključeni v replikacjo in mobilizacijo plazmidov). Tri glavne družine so Rep_1, Rep_2, Rep_trans. Nekateri elementi RCR se lahko vključijo tudi v gostiteljske genome, kar povzroča težave pri njihovem razvrščanju. [1]

Replikacijski mehanizem

Iniciacija replikacije se začne z vezavo Rep proteina (DNA-relaksaza) na mesto dso (double-strand origin) dodatno zvite plazmidne DNA, s čimer se oblikuje struktura lasnične zanke.Rep protein preko Tyr napade specifičen dinukleotid na dso in povzroči cepitev ene verige (ustvari zarezo). Nastane kovalentna vez med aminoacilnim ostankom Rep in DNA, s čimer se ustvari Rep-DNA kompleks. Prost 3’ konec z -OH skupino služi kot primer za sintezo komplementarne verige za gostiteljsko DNA polimerazo III. Encimi gostitelja tako sintetizirajo novo verigo DNA. Med to fazo Rep protein ostane kovalentno vezan na 5’ konec prvotne DNA. DNA helikaze in pomožni proteini pomagajo pri razvijanju in stabilizaciji prvotne DNA, ki se razvija. Ko se replikacija bliža koncu, Rep protein zopet katalizira reakcijo transesterifikacije na mestu prej nastale zareze, kar vodi do združitve koncev in sprostitve na novo sintetizirane verige kot sproščeno dvoverižno DNA. Ta starševsko verigo zapusti v enoverižni obliki. Enoverižni intermediat DNA, značilen za RCR plazmide, se z DNA- in RNA-polimerazami, ki prepoznajo mesto sso, pretvori v dvoverižno obliko. DNA-ligaza in DNA-giraza zaključita proces z zlepljenjem in dodatnim zvijanjem novonastale plazmidne molekule.

Geni za odpornost na antibiotike (Abr)

Glavni nosilci širjenja genetskih lastnosti, vključno z geni za odpornost na antibiotike (Abr), so bakterijski plazmidi. Pomembna je lokacija Abr genov in zakaj se le-ti nahajajo ravno na plazmidih in ne na kromosomih. Potrjeno je, da pride do povečane možnosti pojava Abr gena na plazmidih, ker imamo povečano število kopij oz. tarč le-teh kot pa kromosomov ter zaradi pogostosti prenosa plazmidov in tudi števila vrst, ki si gen in plazmid delita. To velja predvsem za majhne plazmide RCR, ker imajo boljšo sposobnost rekombinacije. Vmesni produkti, ki nastajajo ob rekombinaciji, so namreč molekule ssDNA, ki so zelo rekombinogene. Po navadi nosijo samo en gen za Abr. RCR plazmidi spadajo med vsestranske nosilce širjenja odpornosti med bakterijami. mRNA nekaterih Abr genov se zvijajo v sekundarne strukture, kar vodi do zaustavitve translacije SD ("Shine-Dalgarno" zaporedje) zaporedja do ribosoma. SD zaporedje je sekvenca na mRNA, ki se nahaja pred začetnim kodonom (AUG) za vodilni peptid. Ta zaporedja vodijo ribosome, da se le-ti vežejo na mRNA in se pravilno poravnajo za pričetek translacije. Ko se zaustavi translacija SD zaporedja (RBS1) to povzroči ponovno zvijanje mRNA in izpostavitev signalov za začetek translacije ribosoma RBS2. Dva najbolj poznana Abr gena plazmidov RCR sta gena, ki kodirata odpornost proti tetraciklinu (Tetr), kloramfenikolu (Cmr) in tudi eritromicinu (Ermr).

Začetki zastajajoče verige

Začetki zastajajoče verige RCR plazmidov in ssDNA fagov so zelo strukturirana in kompleksna območja, kjer se pojavljajo intermediati replikacije- ssDNA in intraverižni DNA pari. Pri tem nastajajo predvsem lasnične zanke, ki imajo izbokline navznoter in so ključne za začetek sinteze zaostale verige DNA. Med plazmidi RCR so najbolj poznane sso (single-strand origins) ssoA, ssoT, ssoW in ssoL.

ssoA

Območje ssoA je bilo opisano v plazmidu pLS1 kot zelo specifično zaporedje, ki je odvisno od orientacije in sodeluje kot signal pri pretvorbi ssDNA v dsDNA obliko. Ta regija je ustvarila eno lasnično zanko s pomočjo intraverižnega parjenja na ssDNA. Regija ssoA je bila prisotna tudi pri drugih plazmidih, kjer se nahajata dve ohranjeni zaporedji in sicer mesto, ki naj bi sodelovalo pri kointegraciji (RSB) in 6-nukleotidno zaporedje na koncu lasnične zanke. V bližini RSB se nahaja tudi promotor ssDNA, ki nosi vezavno mesto za RNA polimerazo. Ko se RNA polimeraza veže, se začne prepisovanje pRNA, ki predstavlja začetek transkripcije zaostale verige.

ssoU

To območje pa predstavlja signal za pretvorbo ssDNA v dsDNA pri različnih bakterijah G+ ter nosi pomembno vlogo pri proliferaciji plazmidov. Za razliko od ssoA, imamo ssoU bolj kompleksno strukturo, saj ga sestavljajo tri lasnične zanke. Na lasnični zanki II se nahaja zaporedje RBS, na katerega se veže RNA polimeraza in sintetizira 45nt dolgo pRNA. Glede na raziskave so ugotovili, da je konjugativna mobilizacija med bakterijami najučinkovitejša metoda prenosa, kadar plazmid vsebuje nepoškodovano ssoU. Ugotovili so, da plazmid pMV158 nima le dveh funkcionalnih regij, temveč ima tudi alternativno regijo alt_ssoA, ki je lahko uporabljena kot rezervni signal za sintezo zaostalih verig. Za proliferacijo plazmidov je tako najpomembnejši plazmid pMV158, ker vsebuje ssoA in ssoU ter dodatno rezervno alt_ssoA in tako lahko konolizira več gostiteljev.

Iniciatorski in terminalni proteini

Poznamo dve vrsti začetnih proteinov. Rep proteini, ki sodelujejo pri replikaciji in Mob proteini, ki sodelujejo pri njihovi konjugativni mobilizaciji. Obe vrsti spadata pod HUH endonukleaze, ki sodelujejo pri replikaciji plazmidov, fagov in virusov. Rep protein začnejo in končajo replikacijo ter oblikujejo oligomere in interagirajo s proteini, kot so SSB in helikaza PcrA. Mob proteini pa začnejo in končajo mobilizacijo ter tudi interagirajo z drugimi proteini. Oboji kot substrat potrebujejo DNA v enoverižni obliki (dsDNA). Vezava teh proteinov na ciljno DNA ukrivi verigo in spodbudi tvorbo zanke, kar vodi do izpostavljenosti zarezovanja v neparni konfiguraciji.

Delovanje Rep proteinov

Rep proteini plazmidov RCR imajo cepitveno in povezovalno dejavnost na enoverižni DNA(ssDNA), ki jo izvede tirozinski ostanek. Le-ta se kovalentno poveže s 5‘-fosfotirozinom z DNA, pri čemer ostane prosta 3’-OH skupina pri razrezanem dinukleotidu. 3‘-OH konec deluje kot replikacijski začetnik in hkrati kot nukleofil med razgradnjo fosfotirozinovega intermediata.

Relaksazna funkcija MobM

MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen). Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu.

Represorji

V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

Protismerna RNA II

Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija). copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta. RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep). Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho.¬ copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

Transkripcijski represorski protein CopG

Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno. Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°. CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige. Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

Gostiteljeve funkcije

PcrA helikaza

Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja. Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori). Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata). Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

DNA giraza

Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje. Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

ZAKLJUČEK

RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in nizke genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami ter jim nudijo gene za uspešnejše preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike in izkoriščanja polnega potencijala sodobne medicine.